王 艷，林禮務(wù)，陳志奎，薛恩生，楊 菁，俞麗云

眼鏡蛇毒是一類天然毒性物質(zhì)，含有多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類等，具有廣泛的生物學(xué)活性。其中眼鏡蛇毒細胞毒素(cobra venom cytotoxin，CTX)是眼鏡蛇毒的主要成分之一，是一類既具有心臟毒性，又具有細胞毒性尤其是對腫瘤細胞有毒性的組分，在抗腫瘤方面具有一定的應(yīng)用前景。誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是許多化療藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機制。我們采用CTX在體外作用于人肝癌細胞BEL-7404，從分子水平觀察CTX對人肝癌細胞的凋亡作用以及對線粒體及細胞質(zhì)細胞色素C的影響，探討CTX的抗癌機制，從而為CTX治療肝癌提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝癌細胞系BEL-7404(由福建省肝膽外科研究所惠贈)。

1.1.2 主要試劑 CTX由本研究所從中華眼鏡蛇毒粗毒(廣州新源蛇毒公司)中分離純化而得［1］;BCA蛋白測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程公司);RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司);小鼠抗人Cytochrome C，β-actin單克隆抗體，兔抗人 caspase-3、-9多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗、兔抗小鼠二抗(Santa Cruz公司產(chǎn)品);caspase-3、-9活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖試驗與光鏡觀察 將BEL-7404細胞制備成單細胞懸液，以1×109·L－1濃度接種于96孔板(每孔100 μl)，每孔加入用完全培養(yǎng)基配制成終濃度為0.5、1、2 和3 mg·L－1的眼鏡蛇毒細胞毒素200 μl，對照組加入等量完全培養(yǎng)液，每個藥物濃度設(shè)3個平行孔，藥物作用12、24和48 h后，MTT法［2］檢測細胞增殖活性，并計算細胞增殖抑制率(%)和半數(shù)抑制濃度(IC50)。并在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變。

1.2.2 腫瘤細胞凋亡檢測 用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)標(biāo)記凋亡細胞。收集腫瘤細胞，分3個組，分別為生理鹽水組、CTX 1 mg·L－1組和 CTX 3 mg·L－1組，作用時間為24 h。結(jié)果判定:凋亡陽性細胞的細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。400倍高倍顯微鏡下，隨機觀察5個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，計算出凋亡細胞的百分率。即凋亡指數(shù)(AI)/%=(TUNEL染色陽性細胞數(shù)/腫瘤細胞數(shù))×100%。

1.2.3 透射電鏡觀察 收集分別經(jīng)對照組及CTX 1 mg·L－1和 CTX 3 mg·L－1處理24 h 的 BEL-7404細胞各1×106個，3%戊二醛固定，2 500 r·min－1離心，去上清，細胞團經(jīng)1%鋨酸后固定、脫水、浸透、包埋、超薄切片、鈾－鉛復(fù)染后，透射電鏡下觀察。

1.2.4 caspase-3、-9 活性檢測 收集分別經(jīng) 0、1、2和3 mg·L－1的CTX處理24 h的BEL-7404細胞各1×106個，用試劑盒提供的裂解液懸浮，冰上孵育10 min，4 ℃、14 000 ×g離心1 min，收集上清，Bradford法進行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度為1×103mg·L－1，取檢測緩沖液 80 μl加 caspase-3 或 caspase-9 10 μl，再加入 Ac-DEVD-ρNA(2 mol·L－1)10 μl后混勻，37℃遮光孵育1～2 h，發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時即可測定A405。樣品的A405扣除空白對照的A405，即為樣品中caspase-3催化產(chǎn)生的ρNA的吸光度。通過標(biāo)準曲線的對比就可以計算出樣品中催化產(chǎn)生了多少量的ρNA。計算:活化倍數(shù)=試驗組ρNA值/對照組ρNA值。

1.2.5 Western blot檢測細胞色素 C 和 caspase-3、-9蛋白的表達 線粒體/細胞質(zhì)蛋白提取:分別收集1和3 mg·L－1的CTX處理24 h的BEL-7404細胞，600×g離心5 min，棄上清，細胞沉淀用細胞質(zhì)提取緩沖液重懸，Dounce勻漿器破碎細胞，700×g離心10 min，收集上清，10 000×g離心30 min，上清液為細胞質(zhì)成分。沉淀為線粒體成分，用線粒體提取緩沖液重懸，渦旋混合器混合10 s。Bradford法對提取的蛋白進行定量，以40 μg蛋白上樣量進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，漂洗后一抗，二抗孵育，洗膜后加入顯色劑顯色。每個樣本重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 眼鏡蛇毒細胞毒素抗腫瘤細胞增殖作用 體外培養(yǎng)的人肝癌BEL-7404與眼鏡蛇毒細胞毒素孵育后，部分細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落(Fig 1A)，隨著時間的延長和劑量的增大，壞死的細胞越來越多(Fig 1B)，具有明顯的劑量依賴效應(yīng)和時間依賴效應(yīng)。而對照組人肝癌BEL-7404卻貼壁生長良好，僅個別細胞貼壁能力降低，漂浮起來(Fig 1C)。眼鏡蛇毒細胞毒素對人肝癌BEL-7404細胞12、24和48 h 的 IC50分別為 2.56、1.94 和 1.35 mg·L－1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見Tab 1。

Tab 1 Cytotoxic effect of CTX on BEL-7404 in vitro ± s，%)

Tab 1 Cytotoxic effect of CTX on BEL-7404 in vitro ± s，%)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs 12 h group;△P＜0.05 vs 24 h group

Concentration/mg·L－112 h 24 h 48 h Control 0.12 ±0.03 0.57 ±0.11 1.21 ±0.17 0.5 15.71 ±2.67* 24.36 ±2.54# 29.42 ±1.87△1 27.85 ±1.87* 39.82 ±1.15# 43.36 ±2.35△2 39.62 ±2.15* 52.37 ±1.65# 61.54 ±1.46△3 57.39 ±2.33* 69.43 ±2.27# 80.32 ±2.33△

2.2 腫瘤細胞凋亡檢測結(jié)果 生理鹽水組TUNEL標(biāo)記的陽性細胞數(shù)較少，AI值為5.3%，給藥組TUNEL標(biāo)記的陽性細胞數(shù)增多，CTX 1 mg·L－1組和CTX 3 mg·L－1組 AI值分別為 38.5%和77.8%。

2.3 透射電鏡觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)改變 透射電鏡下觀察對照組細胞細胞核形態(tài)規(guī)則，細胞膜完整，核仁清晰，染色質(zhì)均勻分布于細胞核內(nèi)，胞質(zhì)內(nèi)線粒體等細胞器清晰可見(Fig 2A)。給藥組大部分腫瘤細胞出現(xiàn)典型的凋亡征象:如線粒體明顯腫脹，部分溶解(Fig 2B)，細胞膜皺縮、染色質(zhì)固縮、核仁裂解為大小不均一的碎塊(Fig 2C)。

Fig 1 BEL-7404 proliferation inhibited by CTX in vitroA:BEL-7404 treated for 2 h;B:BEL-7404 treated for 48 h;C:control

Fig 2 Apoptotic morphological changes of BEL-7404 treated by CTX

2.4 caspases酶活性的影響 給藥組caspase-3，-9酶活性均有提高，且隨著濃度的增加，活化的倍數(shù)隨著提高，見Tab 2。

Tab 2 Enzyme activity of caspase-9，-3 increased by CTX in BEL-7404

2.5 Western blot檢測結(jié)果

2.5.1 細胞色素C(Cytochrome C)分布變化 對照組線粒體內(nèi)Cytochrome C表達較多，CTX組表達量較少，且3 mg·L－1劑量組與空白對照組相比更為明顯。而細胞質(zhì)內(nèi)Cytochrome C表達則相反，對照組表達較少，CTX組表達量增加，且3 mg·L－1劑量組與空白對照組相比更為明顯(Fig 3)。

Fig 3 Expression of cytochrome C proteins in each group

2.5.2 caspase-3、-9蛋白的表達 對照組 caspase-3、-9蛋白僅少量表達，CTX組表達量增多，且3 mg·L－1劑量組與空白對照組相比更為明顯(Fig 4)。

3 討論

細胞凋亡是一種重要生物學(xué)過程，是由于內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號觸發(fā)，在相關(guān)基因調(diào)控下引起的細胞主動死亡過程。在細胞凋亡機制研究中，目前認為誘導(dǎo)細胞凋亡主要有兩條途徑:一條是死亡受體途徑;另一條是線粒體凋亡途徑［3］。線粒體在凋亡早期先于核或染色體的改變即出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的變化，已研究證實線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔(MPTP)開放是細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)［4－5］。在致凋亡因子的刺激下，細胞線粒體跨膜電位降低或喪失［6－7］，線粒體釋放細胞色素 C和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)至細胞質(zhì)中［8－9］，它們可與凋亡相關(guān)蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)結(jié)合，在有脫氧三磷酸腺苷(dATP)存在的情況下，激活 Apaf-1［10］，活化的Apaf-1可以結(jié)合caspase-9酶原而將其切割和活化。caspase-9處于caspase“瀑布式”激活的頂端，導(dǎo)致細胞凋亡過程的啟動［11］?；罨腸aspase-9裂解后可激活caspase-3和下游眾多的caspase蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)。其中caspase-3被認為是級聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶，是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路［12－13］?；罨腸aspase-3引起caspase級聯(lián)反應(yīng)，完成整個細胞凋亡和清除過程，包括DNA片段化、染色體固縮、細胞膜水泡樣變、細胞皺縮并向內(nèi)形成凋亡小體，最終引起染色體DNA及細胞的解體［14］。

Fig 4 Expression of caspase proteins in each group

本研究中證實CTX具有較強的毒性作用，可誘導(dǎo)人肝癌細胞凋亡，且具有明顯的劑量依賴效應(yīng)和時間依賴效應(yīng)。給藥組線粒體明顯腫脹，細胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)增多，提示腫瘤細胞凋亡可能與線粒體參與的途徑有關(guān)。給藥組caspase-3、-9表達增加，酶活性明顯增高均提示:caspase-3、-9參與了線粒體凋亡途徑。我們認為CTX首先通過線粒體細胞色素C釋放，進一步誘導(dǎo)效應(yīng)性caspase-9、-3蛋白酶激活，最終誘導(dǎo)人肝癌細胞凋亡，這可能是其在體內(nèi)產(chǎn)生抗腫瘤作用的機制之一。

［1］ 陳志奎，林禮務(wù)，林 琦，等.眼鏡蛇毒細胞毒素緩釋微球制備及體外性質(zhì)研究［J］.中國生化藥物雜志，2008，29(3):161－4.

［1］ Chen Z K，Lin L W，Lin Q，et al.Preparation and characterization of poly(lactide-co-glycolide acid)microspheres containing cytotoxin from Naja Naja Atra venom［J］.Chin J Biochem Pharmaceutics，2008，29(3):161 －4.

［2］ 曹 波，雷志勇，陳虹新，等.新的微管抵制劑YB-13誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡及其機制［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24(1):123－7.

［2］ Cao B，Lei Z Y，Chen H X，et al.YB-13，a novel synthetic microtubule inhitor，induces apoptosis of HeLa cells and its mechanism［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(1):123 －7.

［3］ Sinha I，Sinha-Hikim A P，Hannawa K K，et al.Mitochondrialdependent apoptosis in experimental rodent abdominal aortic aneurysms［J］.Surgery，2005，138(4):806 －11.

［4］ Dias N，Bailly C.Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth［J］.Biochem Pharmacol，2005，70(1):1－12.

［5］ Lucken-Ardjomande S，Montessuit S，Martinou J C.Changes in the outer mitochondrial membranes during apoptosis［J］.J Soc Biol，2005，199(3):207 －10.

［6］ Ly J D，Grubb D R，Lawen A.The mitochondrial membrance potential(deltapsi(m))in apoptosis;an update［J］.Apoptosis，2003，8(2):115－28.

［7］ Armstrong J S.Mitochondrial membrance permeabilization:the sine qua non for cell death［J］.Bioessays，2006，28(3):253 －60.

［8］ Hong S J，Dawson T M，Dawson V L.Nuclear and mitochondrial conversations in cell death:PARP-1 and AIF signaling［J］.Trends Pharmacol Sci，2004，25(5):259 －64.

［9］ Yu W，Sanders B G，Kline K.RRR-alpha-tocopheryl succinateinduced apoptosis of human breast cancer cells involves Bax translocation to mitochondria［J］.Cancer Res，2003，63(10):2483 －91.

［10］李 冰，褚現(xiàn)明，高美華，張學(xué)成.鈍頂螺旋藻藻藍蛋白誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡的分子機制研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(8):1045－50.

［10］ Li B，Chu X M，Gao M H，Zhang X C.Study on the molecular mechanism of C-phycocyanin from Spirulina platensis induced apoptosis in HeLa cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(8):1045－50.

［11］ Allan L A，Clarke P R.Apoptosis and autophagy:Regulation of caspase-9 by phosphorylation［J］.FEBS J，2009，276(21):6063－73.

［12］ Eldadah B A，F(xiàn)aden A I.Caspase pathways，neuronal apopotosis，and CNS injury［J］.J Neurotrauma，2000，17(10):811 －29.

［13］費洪榮，肖 婷，陳 庚，等.告達庭對人胃癌細胞株SGC-7901細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(10):1330－3.

［13］ Fei H R，Xiao T，Chen G，et al.Effect of caudatin on cell proliferation and apoptosis in human gastric cancer cell line SGC-7901［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(10):1330 －3.

［14］ Salvesen G S，Dixit V M.Caspases:intracellular signaling by proteolysis［J］.Cell，1997，91(4):443 －6