李 帥，楊 嫻，索占偉，時(shí) 蕾，劉燕妮，曹 靜，許英明，胡曉東

脊髓背角NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)型谷氨酸受體在慢性病理性疼痛的形成和維持中發(fā)揮重要作用［1］。外周組織或神經(jīng)損傷，通過促進(jìn)NMDA受體的突觸輸送(synaptic trafficking)、增加NMDA受體的突觸表達(dá)［2］，或者通過催化NMDA受體發(fā)生磷酸化、提高 NMDA受體的鈣通透性［3］，誘發(fā) NMDA受體的功能亢進(jìn);抑制脊髓NMDA受體，則能明顯緩解慢性炎性疼痛或神經(jīng)病理性疼痛癥狀［4］。因此，NMDA受體成為重要的鎮(zhèn)痛干預(yù)靶點(diǎn)。

NMDA受體是由 NR1、NR2(NR2A-NR2D)、NR3(NR3A-NR3B)亞基通過組合而成的異源性四聚體。脊髓最常見的NMDA受體由兩個(gè)NR1和兩個(gè)NR2A(簡(jiǎn)稱 NR2A受體)或兩個(gè) NR1和兩個(gè)NR2B(簡(jiǎn)稱NR2B受體)所組成。對(duì)NMDA受體亞型的深入研究發(fā)現(xiàn):NR2B受體與慢性疼痛的關(guān)系尤為密切［4］。資料顯示:外周組織損傷之后，脊髓NR2B受體的功能會(huì)異常升高，特異性抑制NR2B受體，會(huì)產(chǎn)生和非特異性NMDA受體抑制劑相似的鎮(zhèn)痛效應(yīng)［2，5］，提示 NR2B 受體在慢性疼痛中的核心作用。

NR2B受體的功能受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中，在NR2B的第1472位包含一個(gè)關(guān)鍵性的酪氨酸殘基(即:NR2B-Y1472)［6］。Src 家族酪氨酸激酶對(duì)NR2B-Y1472的磷酸化，不僅提高NR2B受體的鈣通透性，而且明顯增強(qiáng)NR2B受體在突觸中的表達(dá)、易化NR2B受體介導(dǎo)的痛覺信息的突觸傳遞［5］。但值得關(guān)注的是:Src家族酪氨酸激酶的活性以及NR2B-Y1472的磷酸化，都受到酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)的控制［7－8］。因此，本研究設(shè)想:PTPs可能直接或間接的影響NR2B受體的酪氨酸磷酸化水平，參與中樞敏感化的形成過程。為此，本研究建立慢性炎性疼痛模型，通過鞘內(nèi)注射PTPs抑制劑正釩酸鈉(sodium orthovanadate，Na3VO4)，探討PTPs對(duì)炎性疼痛的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Na3VO4(上海中秦);完全弗氏佐劑(CFA，Sigma);多克隆兔抗 NR2B抗體 (Millipore Corporation，Temecula，CA，USA);多克隆兔抗NR2B-Y1472磷酸化抗體 (Millipore);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(Jackson Immuno Research Laboratories，Baltimore，PA，USA);Von Frey 纖 維(Stoelting，Wood Dale，IL，USA);PVDF膜 (Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 正釩酸鈉的活化 為使正釩酸鈉解聚、增強(qiáng)正釩酸鈉的PTPs抑制活性，本研究首先制備200 mmol·L－1的正釩酸鈉水溶液，隨后調(diào)節(jié) pH至10.0，煮沸、直至無色，冷卻至室溫，重新調(diào)節(jié)pH至10.0，再次煮沸至無色，重復(fù)3～4次，直至溶液無色。調(diào)節(jié)pH至10.0，置于－20℃?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 疼痛模型 ♂昆明種小鼠，18～22 g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。左后足底皮下注射20 μl的CFA，對(duì)照組注射等容量的生理鹽水［2］。

1.2.3 縮足閾值的測(cè)定 在造模前、后，以 Up-Down法測(cè)定Von Frey纖維誘發(fā)的小鼠機(jī)械性縮足閾值 (paw withdrawal threshold，PWT)［5］。

1.2.4 運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試 以翻正反射時(shí)間和“抓/爬”滯留時(shí)間，評(píng)價(jià)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能［10］。翻正反射時(shí)間＜1.5 s為正常;“抓/爬”能力測(cè)試時(shí)，小鼠置于垂直的金屬網(wǎng)格上，滯留時(shí)間＞30 s為正常。

1.2.5 鞘內(nèi)給藥 小鼠用乙醚淺麻醉，一根25 μl的無菌微量進(jìn)樣器針頭，于L5-L6棘突間隙插入，以產(chǎn)生空洞感、并伴隨動(dòng)物的輕微甩尾，作為針尖進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的標(biāo)志，緩慢推注藥物5 μl，對(duì)照組注射等容量的生理鹽水［5］。

1.2.6 磷酸化的測(cè)定 小鼠用苯巴比妥鈉 (30 mg·kg－1，ip.)麻醉，暴露并分離 L4-L5節(jié)段脊髓背角，在 4℃ 的 RIPA 緩沖液 ［50 mmol·L－1Tris·HCl，pH 8.0，150 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1EDTA，1.0%NP-40(V/V)，1 g·L－1SDS，5 g·L－1sodium deoxycholate，5 mmol·L－1EGTA，10 mmol·L－1NaF，1 mmol·L－1Na3VO4，1 mmol·L－1PMSF，以及 aprotinin、chymostatin、leupeptin、antipain、pepstatin 各 1 g·L－1］中，制備組織勻漿;14 000×g離心10 min(4℃)，測(cè)定上清的總蛋白含量，Western blot檢測(cè)NR2B-Y1472的磷酸化水平。隨后，PVDF膜用洗脫緩沖液［stripping buffer，成分:5 mmol·L－1Tris·HCl，pH 6.8，20 g·L－1SDS，0.5% β-mercaptoethanol(V/V)］在 70℃洗脫 30 min，以抗 NR2B的特異性抗體檢測(cè) NR2B的含量［5］。

1.2.7 免疫印跡 20 μg蛋白上樣，8%SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，洗滌，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯像，Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 NR2B-Y1472磷酸化的免疫反應(yīng)密度值與NR2B的免疫反應(yīng)密度值相比(NR2B-pY1472/NR2B)，以消除上樣量的差異。各處理組與對(duì)照組相比較，結(jié)果以ˉ±s表示。采用One-way ANOVA結(jié)合post-hoc Tukey HSD檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 鞘內(nèi)注射正釩酸鈉對(duì)正常小鼠縮足閾值的影響 為觀察正釩酸鈉對(duì)正常動(dòng)物痛閾的影響，本實(shí)驗(yàn)取小鼠鞘內(nèi)注射正釩酸鈉50、100和200 ng，檢測(cè)縮足閾值(PWT)的變化，發(fā)現(xiàn):正釩酸鈉對(duì)正常動(dòng)物的PWT值無明顯影響(Fig 1)，各時(shí)間點(diǎn)的PWT值和生理鹽水注射組動(dòng)物相比較，差異無顯著性，提示:在生理?xiàng)l件下，脊髓PTPs無活性或活性較低，對(duì)脊髓痛覺信息的傳遞與整合無影響。各劑量的正釩酸鈉也不影響小鼠的運(yùn)動(dòng)功能，動(dòng)物的翻正反射正常(均＜1.5 s)，抓/爬能力正常(均＞30 s)。

Fig 1 Intrathecal application of sodium orthovanadate(Na3VO4 50 ng，100 ng，200 ng)has no significant effects on the paw withdrawal threshold values of intact mice(±s，n=4)

2.2 鞘內(nèi)注射正釩酸鈉對(duì)CFA誘發(fā)的炎性疼痛的影響 注射CFA前、后連續(xù)檢測(cè)縮足閾值的變化，發(fā)現(xiàn):注射CFA后24 h，小鼠的縮足閾值明顯降低(Fig 2)，表現(xiàn)出明顯的機(jī)械性痛覺超敏，說明炎性疼痛的形成。此時(shí)，鞘內(nèi)注射正釩酸鈉50 ng，對(duì)炎性疼痛小鼠的PWT值無影響(Fig 2);增大正釩酸鈉的劑量至100 ng和200 ng，則炎性疼痛小鼠的PWT值會(huì)快速升高(Fig 2)，在給藥后30 min，CFA組動(dòng)物的PWT值從(0.24±0.07)g升高至(1.07±0.51)g(P＜0.05，n=4)和(1.38±0.47)g(P ＜0.05，n=4)，提示:外周組織損傷能夠激活脊髓PTPs，使之在痛覺超敏的形成中發(fā)揮重要作用;抑制PTPs的活性，則劑量依賴性地緩解炎性疼痛癥狀。

Fig 2 Paw withdrawal threshold of mice significantly decreases one day after intradermal injection of complete Freund’s adjuvant(CFA;20 μl)，which，however，can be reversed by intrathecal application of sodium orthovanadate(Na3VO4)in a dose-dependent manner(ˉ±s，n=4)

2.3 鞘內(nèi)注射正釩酸鈉對(duì)CFA誘發(fā)的NR2B酪氨酸磷酸化的影響 為探討脊髓PTPs對(duì)NMDA受體的調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)在注射CFA后24 h鞘內(nèi)給予正釩酸鈉100 ng，經(jīng)過30 min后，立即分離損傷側(cè)脊髓背角，測(cè)定NR2B-Y1472的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn):注射CFA之后，脊髓背角NR2B-Y1472的磷酸化水平會(huì)明顯升高(Fig 3)，和生理鹽水對(duì)照組動(dòng)物相比較差異具有顯著性(P＜0.05)，說明:CFA誘發(fā)的NR2B-Y1472的磷酸化參與痛覺超敏的形成;而用正釩酸鈉100 ng處理炎性疼痛動(dòng)物30 min后，NR2B-Y1472的磷酸化水平會(huì)重新降低(Fig 3)，和生理鹽水對(duì)照組動(dòng)物相比較，差異不具有顯著性(P＞0.05)，提示:正釩酸鈉通過抑制脊髓PTPs的活性，能夠逆轉(zhuǎn)組織損傷誘發(fā)的NR2B的酪氨酸磷酸化，有效緩解炎性疼痛癥狀。

3 討論

目前認(rèn)為，酪氨酸磷酸酶(PTPs)的作用在于催化底物的去磷酸化;抑制PTPs的活性，會(huì)升高其底物的酪氨酸磷酸化水平。但本研究首次發(fā)現(xiàn):鞘內(nèi)注射PTPs抑制劑正釩酸鈉，不但不會(huì)升高，反而會(huì)降低NR2B-Y1472的磷酸化水平，明顯緩解慢性炎性疼痛癥狀，提示:外周組織損傷可能激活脊髓PTPs，促進(jìn)NR2B的酪氨酸磷酸化，誘發(fā)NR2B受體的功能亢進(jìn)，最終導(dǎo)致慢性疼痛的形成。

Fig 3 Intrathecal application of sodium orthovanadate(Na3VO4 100 ng)for 30 min represses the phosphorylation of NR2B subunit at Tyr1472(NR2B-pY1472)in spinal dorsal horn of mice one day after CFA injection(n=4)

如何解釋這一看似“矛盾”的結(jié)果呢?大量的資料證實(shí):Src家族酪氨酸激酶尤其是其成員Src和Fyn，能夠直接催化 NR2B-Y1472 發(fā)生磷酸化［5］;這一作用被認(rèn)為是誘發(fā)和維持慢性炎性疼痛的關(guān)鍵性事件。然而，在Src家族激酶的分子結(jié)構(gòu)中，存在2個(gè)重要的、保守的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，即:Src激酶催化活性區(qū)域(kinase domain)第418位的酪氨酸(Y418)以及Src的C-末端第529位酪氨酸(Y529);Y418的磷酸化和Src家族激酶的活性成正相關(guān)［11］，而Y529發(fā)生磷酸化則會(huì)和Src的SH2(Src Homology-2)結(jié)構(gòu)域發(fā)生分子內(nèi)的結(jié)合，通過分子變構(gòu)而導(dǎo)致Src激酶的滅活［11］;雖然Y418和Y529的磷酸化都受到PTPs的控制，但有意思的是:某些PTPs能夠去磷酸化Y418，使得Src激酶失活，因此，這些PTPs的作用可能是“抑制性”的［12］;然而另一些PTPs則能夠選擇性地去磷酸化Y529，暴露Src的激酶活性區(qū)域，導(dǎo)致Src激酶的激活，因而這些PTPs的作用可能是“興奮性”的［13］。本研究結(jié)果顯示:PTPs的非特異性抑制劑正釩酸鈉，能夠明顯降低炎性疼痛小鼠脊髓背角NR2B-Y1472的磷酸化，明顯緩解炎性疼痛癥狀，提示:外周組織損傷，可能優(yōu)先激活脊髓背角中的“興奮性”PTPs，或者組織損傷之后“興奮性”PTPs的功能會(huì)相對(duì)占優(yōu)勢(shì)，從而使“興奮性”PTPs在中樞敏感化的形成中發(fā)揮重要作用。PTPs大家族包含有眾多的成員［12，14］，究竟哪種 PTPs表達(dá)于脊髓背角以及外周組織損傷，究竟激活哪種PTPs參與慢性疼痛的形成等問題，尚有待于大量而細(xì)致的研究。

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