楊惠琴 梅亞寧

(1.江蘇省東臺(tái)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，東臺(tái)224200;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京210029)

近年來隨著廣譜抗菌藥物，高強(qiáng)度免疫抑制劑和抗腫瘤藥物的廣泛應(yīng)用，以及造血干細(xì)胞、實(shí)體器官移植的廣泛開展，各種導(dǎo)管的體內(nèi)介入、留置等，臨床上侵襲性真菌感染 (invasive fungal infections，IFI)的患病率明顯上升。在醫(yī)院感染中占重要地位，引起臨床極大重視，深部真菌病的療效與轉(zhuǎn)歸，很大程度上取決于能否早期診斷。傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)與鑒定需要時(shí)間較長。研究表明，除接合菌外，所有真菌細(xì)胞膜上都含有 (1，3)-β-D-葡聚糖，而其他微生物、動(dòng)物及人的細(xì)胞成分和細(xì)胞外液都不含這種成分，因此在機(jī)體的體液中檢測到(1，3)-β-D-葡聚糖是診斷深部真菌感染的有效依據(jù)［1］。我們應(yīng)用MB-80微生物動(dòng)態(tài)快速檢測系統(tǒng)，對(duì)臨床疑似深部真菌感染患者血漿中 (1，3)-β-D-葡聚糖的檢測，并與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法加以對(duì)比，探討血漿 (1，3)-β-D-葡聚糖檢測對(duì)深部真菌感染患者的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選擇2009年8月～2010年7月，我院住院疑似深部真菌感染的患者共1 868例 (其中男1 177例，女691例，年齡在17～90歲。

1.2 方法

在1 868例患者抽取靜脈血做 (1，3)-β-D-葡聚糖檢測和真菌培養(yǎng)的同時(shí)留取痰、中段尿、膿等分泌物標(biāo)本做真菌培養(yǎng)，特殊患者留取腹水和腦脊液進(jìn)行真菌培養(yǎng)。采用回顧性調(diào)查方法查閱患者住院病歷，了解臨床診斷 (患者的影像學(xué)，使用抗真菌藥物癥狀是否緩解等)，并以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 真菌分離培養(yǎng)及鑒定

標(biāo)本的留取和真菌分離培養(yǎng)均按“全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程”第三版進(jìn)行操作。真菌鑒定，酵母菌采用CHRO Magar Candida顯色培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落顏色鑒定白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌。不能用顯色培養(yǎng)基鑒定的菌株，用沙氏培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)48 h，分離純化，用API 20C AUX鑒定到種，仍不能鑒定到種的為其他念珠菌;絲狀真菌接種于察氏瓊脂根據(jù)菌落形態(tài)、色素及鏡下結(jié)構(gòu)作出菌種鑒定。

1.4 (1，3)-β-D-葡聚糖檢測

應(yīng)用北京金山川科技有限公司MB-微生物動(dòng)態(tài)快速檢測系統(tǒng)及KT-5M Set動(dòng)態(tài)真菌檢測試劑盒定量檢測血漿中 (1，3)-β-D-葡聚糖含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

分別計(jì)算G試驗(yàn)臨界值為20 pg/mL和50 pg/mL時(shí)的敏感度 (診斷試驗(yàn)陽性患者/患者總數(shù)×100%)、特異度 (診斷試驗(yàn)陰性的非患者/患者總數(shù)×100%)、陽性預(yù)測值 (真陽性結(jié)果數(shù)/陽性試驗(yàn)結(jié)果總數(shù)×100%)和陰性預(yù)測值 (真陰性結(jié)果數(shù)/陰性試驗(yàn)結(jié)果總數(shù)×100%);真菌培養(yǎng)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值;以及兩試驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用后敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。

2 結(jié) 果

2.1 臨床診斷情況

通過回顧性調(diào)查，1 868例患者中經(jīng)臨床用藥、臨床體征變化及組織學(xué)影像學(xué)等診斷標(biāo)準(zhǔn)臨床診斷為深部真菌感染757例，非感染1 082例。無臨床資料的29例 (剔除);實(shí)際有效病例1 839例。其中 (1，3)-β-D-葡聚糖含量檢測陽性778例，陰性1 061例，真菌培養(yǎng)陽性457例，陰性1 382例。

2.2 G試驗(yàn)檢測結(jié)果

經(jīng)臨床診斷真菌感染的757例患者中 (1，3)-β-D-葡聚糖含量最高為2 056 pg/mL，最低為11.626 pg/mL，均值為 (563.17 ±172.53)pg/mL;非感染1 082例中 (1，3)-β-D-葡聚糖含量最高為156 pg/mL，最低為5.0 pg/mL，均值為 (3.37 ±1.03)pg/mL;兩組 (1，3)-β-D-葡聚糖含量差異顯著(P ＜0.01)。

2.3 G試驗(yàn)敏感度、特異度

以20 pg/mL為臨界值時(shí)，G試驗(yàn)陽性778例，敏感度和特異度分別為89.3%和90.6%;陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為86.9%和92.4%;以50 pg/mL為臨界值時(shí)，G試驗(yàn)陽性623例，敏感度和特異度分別為74.9%和94.8%;陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為91.0%和84.4%，G試驗(yàn)與臨床診斷的比較見表1。

表1 G試驗(yàn)與臨床診斷比較Tab.1 Clinical data between groups

2.4 真菌培養(yǎng)結(jié)果菌種分布情況

標(biāo)本來源以呼吸道標(biāo)本為主，泌尿道、腸道次之。有的患者多部位分離出同一種真菌，作1例統(tǒng)計(jì) (歸到無菌體液部位感染)，詳見表2。

表2 真菌培養(yǎng)結(jié)果菌種分布情況(株)Tab.2 Fungi distribution

2.5 真菌培養(yǎng)敏感度、特異度

真菌培養(yǎng)的敏感度和特異度分別為49.0%和92.1%;陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為81.2%和 72.1%。

2.6 聯(lián)合檢測敏感度、特異度

G試驗(yàn)(臨界值20 pg/mL)或真菌培養(yǎng)二者同時(shí)陽性或者其中任一項(xiàng)檢測為陽性時(shí)即判斷為陽性時(shí)，對(duì)于侵襲性真菌感染診斷的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為93.0%，88.9%，45.3%和93.7%。兩種方法對(duì)深部真菌感染的檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 兩種方法對(duì)深部真菌感染的檢驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Deep fungal infection by two different methods

3 討 論

近年來隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用深部真菌感染(invasive fungal infection，IFI)的發(fā)病率呈逐年上升勢態(tài)，介入性操作診療技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，器官移植的普及，使很多危重患者延長了生存時(shí)間，但也是并發(fā)IFI的主要原因之一，盡管采取了有力的抗真菌治療，深部真菌感染的死亡率仍然很高，其重要原因之一就是深部真菌感染的早期診斷困難，延誤了臨床抗真菌的治療，使患者病情惡化，死亡率增加。盡早診斷對(duì)深部真菌感染的治療和預(yù)后有重要作用［2］。

(1，3)-β-D-葡聚糖抗原［(1，3)-β-D-glucan，BG］的檢測，是一種新的真菌抗原檢測方法，在深部真菌感染早期診斷上有著重要意義，近年來備受關(guān)注。(1，3)-β-D-葡聚糖是除接合菌屬外真菌細(xì)胞壁上的一種特征性的多糖成分，其他微生物如細(xì)菌、病毒及動(dòng)物的細(xì)胞外液則缺乏此種多糖，具有真菌特異性。(1，3)-β-D-葡聚糖在真菌生長時(shí)釋放入血，對(duì)數(shù)生長期釋放量最大，在真菌生長1 d后開始下降。其在正常人血漿中的濃度很低 (常低于10 pg/mL)，而深部真菌感染者卻可明顯增高(常高于 20 pg/mL)［3，4］。但對(duì)定植的念珠菌顯示陰性［5］。故檢測患者血中 (1，3)-β-D-葡聚糖可預(yù)測深部真菌感染。

市場上現(xiàn)在常用的試劑盒主要有兩種，一種是日本Seikagaku Kogyo公司研制的Fungitec.G glu-can試劑，一種是美國Cape Code協(xié)會(huì)研制的Glucatell試劑。兩種試劑的主要區(qū)別在于使用不同品種的馬蹄鱟為原材料，F(xiàn)ungitec.G試劑主要成分是東方鱟的細(xì)胞裂解產(chǎn)物，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為20 pg/mL，而Glucatell試劑則使用美洲鱟的細(xì)胞裂解產(chǎn)物作為主要原料，推薦使用的判斷標(biāo)準(zhǔn)為60 pg/mL［6］。目前(1，3)-β-D-葡聚糖的檢測國內(nèi)報(bào)道較多的是采取G試驗(yàn)的方法，國產(chǎn)試劑有北京金山川科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的GKT-5M Set動(dòng)態(tài)真菌檢測試劑盒(定量)，利用MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測系統(tǒng)對(duì)(1，3)-β-D-葡聚糖抗原進(jìn)行檢測。此方法特異性和敏感性可因設(shè)定的陽性臨界值不同而不同，對(duì)陽性界值的設(shè)定也一直在討論中，國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道較多的BG陽性界值設(shè)定分別在50 pg/mL或20 pg/mL。本實(shí)驗(yàn)以50 pg/mL為陽性界值時(shí)，BG檢測的敏感性為74.9%，特異性94.8%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為91.0%和84.4%;以20 pg/mL為臨界值，BG檢測的敏感性和特異性分別為89.3%和90.6%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為 86.9%和 92.4%;與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7，8］。本研究顯示無論以50 pg/mL為陽性界值還是以20 pg/mL為陽性界值時(shí)均有較好的敏感性和特異性，在3例腦脊液培養(yǎng)為隱球菌的病例中有一例BG值為40.3 pg/mL，2 例 ＜20 pg/mL，同時(shí)對(duì)其他臨床病例跟蹤觀察以50 pg/mL為臨界值時(shí)與深部真菌感染有較好的一致性且本試驗(yàn)的假陽性較高，若降低臨界值會(huì)增加試驗(yàn)的假陽性，我們建議臨床采用以50 pg/mL為臨界值。

病原學(xué)檢查(特別是真菌培養(yǎng))，目前在臨床上，對(duì)于深部真菌感染仍然是一種常規(guī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，它能明確引起感染的真菌種類，并可根據(jù)相應(yīng)真菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，為臨床合理使用抗真藥菌物提供有效依據(jù)。但此方法費(fèi)時(shí)，通常需3～5 d;陽性率也不高，且易將正常帶菌者誤診為深部真菌感染，不適宜作早期診斷。本試驗(yàn)中真菌培養(yǎng)陽性率為24.81%，培養(yǎng)陽性標(biāo)本主要來源呼吸道、泌尿道和腸道，約占91.25%，這些部位是菌群失調(diào)的好發(fā)部位，同時(shí)導(dǎo)管的體內(nèi)介入、留置、廣譜抗菌藥物及免疫抑制劑的大量使用，給真菌定植創(chuàng)造了條件。本試驗(yàn)中靠病原學(xué) (真菌培養(yǎng))診斷為深部真菌感染的患者共457例，其中86例缺乏臨床擬診的有效佐證;34例真菌培養(yǎng)陽性，(1，3)-β-D-葡聚糖檢測 ＜ 20 pg/mL 病例中，17例一次痰培養(yǎng)為念珠菌，8例一次糞培養(yǎng)為念珠菌，3例 (均為插導(dǎo)尿管的老年患者)中段尿二次培養(yǎng)為同一種念珠菌，2例腦脊液培養(yǎng)為隱球菌，4例痰培養(yǎng)二次為煙曲霉。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論陽性臨界值為20 pg/mL還是50 pg/mL，均有多例(193、246)與臨床診斷不符的病例，即假陽性和假陰性的問題，這是該檢測方法的不足之處，國內(nèi)外普遍存在。跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)多數(shù)病例的患者檢測前服用過香菇多糖或使用過免疫球蛋白等血液制品、抗腫瘤藥物等，也有數(shù)例腎透析及免疫性疾病 (1例紅斑狼瘡、1例硬皮病)，這可能是，造成假陽性結(jié)果的原因［9-11］。但在跟蹤調(diào)查中我們發(fā)現(xiàn)有4例細(xì)菌血癥(1例大腸埃希菌，1例金黃色葡萄球菌，2例銅綠假單胞菌)BG值也＞150 pg/mL。可能是由于BG的測定原理與內(nèi)毒素十分相似，易受血中細(xì)菌的干擾而造成假陽性。其余為數(shù)不多的不符病例，未找出明顯原因，尚須進(jìn)一步研究和觀察。

總之，G試驗(yàn)作為一種深部真菌感染的初步篩查方法是非常有意義的;使用時(shí)再緊密結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、病原學(xué)檢查等，加強(qiáng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測，就一定能發(fā)揮其快速、準(zhǔn)確的作用，給臨床提供早期治療的依據(jù)，降低病死率，改善預(yù)后。

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