黃欣 沈亮亮 徐紅 溫海

(1.同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院皮膚科,上海 200065;2.第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院皮膚科,上海 200003)

馬拉色菌是人體和其他溫血動物皮膚表面的條件致病性真菌,與該菌有關(guān)的疾病較多包括花斑糠疹、馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特應(yīng)性皮炎等,因涉及病種較多,對其治療也越來越受到重視。目前針對馬拉色菌多為純西藥治療,藥物種類有限,且易反復(fù),因此開發(fā)安全有效的純中藥制劑成為治療方面的一個研究熱點。本研究參照美國臨床和實驗室標準化研究所 CLSI制訂的 M27-A方案中酵母菌微量稀釋法[1],檢測了 8種中藥單體對球形馬拉色菌的體外藥敏試驗,旨在初步篩選出對球形馬拉色菌有抑制作用的中藥單體。

1 材料和方法

1.1 材料

抗真菌藥:酮康唑粉 (西安楊森制藥有限公司,含量 99.9%)特比萘芬粉 (山東齊魯制藥廠,含量 99.9%)。8種中藥單體 (氧化苦參堿、麝香草酚、肉桂酸、丹皮酚、丁香酚、鹽酸小檗堿、苦參堿、黃芩苷)均購自中國藥品生物制品檢定所,均為化學(xué)對照品。實驗菌株:球形馬拉色菌標準株(CBS7966),由中國科學(xué)院皮膚病研究所惠贈。Leeming和 Notman培養(yǎng)基[2]:1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.1%酵母浸膏、0.4%牛膽鹽、0.1%甘油、0.05%單硬脂酸甘油脂、0.05%吐溫 60、1%全脂牛奶、2%橄欖油、1.2%瓊脂、0.5%放線菌酮、0.05%氯霉素。馬拉色菌液體培養(yǎng)基[3]:麥芽浸膏20 g/L、酵母浸膏 2 g/L、葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 20 g/L、玉米油 20 g/L,加蒸餾水溶解后高壓滅菌。

1.2 馬拉色菌的體外藥敏試驗 (參照 CLSI制定的 M27-A方案中酵母菌微量稀釋法)

藥液加樣 酮康唑粉、特比萘芬粉先以二甲基亞砜 (DMSO)溶解,再用馬拉色菌液體培養(yǎng)基稀釋至 2倍實驗濃度,即酮康唑、特比萘芬的終質(zhì)量濃度為 0.03～16μg/mL。丁香酚終質(zhì)量濃度為 0.245～125μg/mL,其余 7種中藥單體為 0.98～500μg/mL。將稀釋的藥物按濃度由高到低依次加入微量藥敏板 96孔酶標板 1～10列中,每孔 100μL,第 11、12列分別加入 100 μL、200 μL馬拉色菌液體培養(yǎng)基 (藥物用 DMSO稀釋者含同濃度的 DMSO),分別作為生長對照和空白對照,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌液制備及接種 將受試菌連續(xù)傳代培養(yǎng) 2次,第 2次 32℃?zhèn)鞔囵B(yǎng) 5 d,用無菌生理鹽水洗脫純化的菌落,制成菌懸液,并調(diào)整其至麥氏 6號比濁管濃度,經(jīng)血細胞計數(shù)板計數(shù)其菌含量為 (1～5)×107CFU/mL,用培養(yǎng)基稀釋菌懸液 103,其菌含量為 (1～5)×104CFU/mL,在 96孔板中 1～11列每孔加入菌液 100μL,使其最終菌濃度為(0.5～2.5)×104CFU/mL。

培養(yǎng)及結(jié)果判定 將接種后的藥敏培養(yǎng)板置32℃濕盒孵育,培養(yǎng) 24 h后觀察結(jié)果,取真菌完全受抑制 (無生長)的最低藥物濃度的試驗孔,即為該藥的最小抑菌濃度 (MIC)。每種藥同時做 3排,結(jié)果取 3個數(shù)的平均值。整個藥敏過程重復(fù) 2次,結(jié)果顯示其 MIC范圍在 1～2個藥物濃度梯度之間。

2 結(jié) 果

2.1 酮康唑、特比萘芬對球形馬拉色菌標準株(CBS7966)的 MIC值均為 0.062 5μg/mL。

2.2 8種中藥單體對球形馬拉色菌標準株(CBS7966)的 MIC值 (見表 1)

由表 1可知 8種中藥單體中苦參堿、氧化苦參堿、麝香草酚、丁香酚對球形馬拉色菌標準株(CBS7966)較敏感。

3 討 論

馬拉色菌是人體和其他溫血動物皮膚表面的正常菌群,與花斑糠疹、毛囊炎、脂溢性皮炎、特應(yīng)性皮炎等疾病有關(guān)。因其涉及病種較多,而相關(guān)的抗真菌藥物種類有限,因此尋找安全性好,抗菌譜廣、療效高而且價格低的抗真菌藥物仍是一項艱巨的任務(wù)。從中藥中提取篩選抗真菌活性成分,進而開發(fā)利用是一個重要的研究方向,具有廣闊的前景。

表 1 8種中藥單體對球形馬拉色菌標準株 (CBS7966)的MIC值 (μg/mL)Tab.1 MICs of M.globosa(CBS7966)toeight chinese herbal components

國內(nèi)外關(guān)于中藥抗馬拉色菌的相關(guān)研究報道較少,國內(nèi)朱敏等報道了 23種中藥及 14種單體抗馬拉色菌的體外藥物敏感研究[3]。國外Hammer[4]和 Weseler[5]等報道了茶樹油抗馬拉色菌的實驗研究。本實驗選用與馬拉色菌相關(guān)皮膚病中較常見的球形馬拉色菌做為實驗菌株對 8種中藥單體進行了初篩試驗,研究結(jié)果表明氧化苦參堿、苦參堿、麝香草酚、丁香酚對球形馬拉色菌較敏感 (MIC<0.98～1.96μg/mL)。麝香草酚 (Thymol),來源于唇形科植物麝香草,其分子式為 C10H14O,對皮膚癬菌具有殺菌作用[6-7]。Fontenelle等[8]報道含有麝香草酚的 L.sidoides精油具有抗馬拉色菌的作用。丁香酚 (Eugenol),來源于桃金娘科植物丁香揮發(fā)油,其分子式為 C10H12O2,丁香酚在 1∶8 000～1∶16 000濃度時,對致病性真菌有抑制作用[6-7]。宋軍等[9]報道表明丁香酚對石膏樣毛癬菌、粉小孢子菌、羊毛狀小孢子菌、紅色毛癬菌、黃癬菌、絮狀表皮癬菌等常見致病真菌均有較強的作用。楊雪云等[10]報道苦參堿和氧化苦參堿對幾種林木病原真菌孢子萌發(fā)均有抑制作用。汪長中等報道[11]苦參堿對體外白念珠菌生物膜抑制作用。而關(guān)于氧化苦參堿、苦參堿、丁香酚抗馬拉色菌的研究報道較少 (經(jīng)檢索 PubMed數(shù)據(jù)庫和萬方數(shù)據(jù)庫)。國內(nèi)、外為數(shù)不多的馬拉色菌體外藥敏實驗報道[12-13]表明,酮康唑、特比萘芬對馬拉色菌均較敏感,與本實驗的體外藥敏實驗結(jié)果一致,酮康唑、特比萘芬的 MIC值均為 0.062 5μg/mL。唑類藥物的藥敏試驗多數(shù)有拖尾現(xiàn)象,在較寬的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)產(chǎn)生部分抑菌。本實驗摸索實驗條件時分別于培養(yǎng)的 24 h、48 h兩個時間點觀察藥敏實驗結(jié)果,發(fā)現(xiàn) 24 h判讀時,結(jié)果清晰,未見拖尾現(xiàn)象。這與朱敏[3]等報道的抗馬拉色菌體外藥敏實驗結(jié)果判讀時間一致。

氧化苦參堿、苦參堿、麝香草酚、丁香酚這 4種中藥單體在體外藥敏實驗中對馬拉色菌具有較好的抑菌效果。酮康唑、特比萘芬的 MIC值均為 0.062 5μg/mL。氧化苦參堿、苦參堿與這 2種西藥的 MIC值是較接近的,這提示我們這 4種中藥單體在抗馬拉色菌方面是有一定開發(fā)前景的。對于馬拉色菌體外藥敏實驗尚無統(tǒng)一的標準化實驗方案。本實驗參考 CLSI M27-A方案,將其用于中藥單體抗馬拉色菌的體外藥敏實驗中,同樣具有實驗結(jié)果易分析、方便、可重復(fù)性等優(yōu)點。

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