趙作濤 孫錚 萬喆 朱平 李若瑜

(1.北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科、北京大學真菌和真菌病研究中心,北京 100034;2.北京大學第一醫(yī)院血液科,北京 100034)

近年來,隨著免疫受損患者不斷增多,侵襲性曲霉病 (Invasive Aspergillosis,IA)的發(fā)病率呈上升趨勢,而且病情十分嚴重。在白血病和骨髓移植受者等重癥免疫受損患者中,IA患者的病死率高達90%,已經成為此類患者死亡的主要原因之一,而煙曲霉是 IA最主要的致病真菌[1-5]。

目前臨床主要還是以各種抗真菌藥物作為 IA的主要治療方法,鑒于 IA的患病率上升、病死率極高,而目前臨床正面臨著抗真菌藥物副作用大、治療效果不理想的險峻形勢,進一步尋找更為有效的治療方法成為目前急需解決的重要問題。大量研究表明細胞免疫,特別是 T細胞免疫在宿主清除煙曲霉感染中具有重要作用,T細胞免疫治療 IA具有重要意義和廣闊的應用前景[6-14]。免疫治療 IA的最大困難在于煙曲霉的抗原成分十分復雜,篩選和鑒定合適的煙曲霉抗原表位,通過體外多肽抗原負載樹突狀細胞 (dendritic cells,DC)誘導抗原肽特異性 CTL產生,對于研究 CTL殺傷煙曲霉的機制和多肽疫苗的制備具有重要意義。因此,本文應用生物信息學手段對煙曲霉抗原 Asp f16進行分析,以國人常見的 HLA-A＊0201位點為靶點,對可能的 CTL抗原表位進行預測,合成多肽并制備多肽特異性 CTL,應用酶聯(lián)免疫斑點法 (Enzymelinked immunosorbent assay,ELISPOT)技術檢測CTL產生的能力,四聚體 (Tetramer)流式細胞儀技術檢測抗原肽特異性 CTL,從而對生物信息學預測的抗原表位進行鑒定,為進一步研發(fā)新型抗煙曲霉T細胞疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

HLA-A＊0201轉基因小鼠 (C57BL/6背景)購自于美國 Jackson Laboratory,于 SPF環(huán)境養(yǎng)殖,轉基因小鼠表達人類 MHC-I類分子 HLA-A＊0201[15]。

1.2 生物信息學預測煙曲霉抗原 Asp f16的 HLAA＊0201限制性 CTL抗原表位

利用文獻報道及生物信息學資源,我們從 NCBI數(shù)據庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得煙曲霉抗原Asp f16(編碼基因 crf1,GenBank entry AJ223327,Genomic locus Afu 1g16190)的全部 427個氨基酸序列,使用由美國國家生物技術中心 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/)和德國Tubingen大學免疫系 (http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)提供的生物信息學軟件掃描了煙曲霉抗原Asp f16的全部 427個氨基酸序列[16]。鑒于國人常見的 HLA位點是 HLA-A＊0201,我們選擇了該位點作為靶點,根據與 HLA分子穩(wěn)定性半衰期評分篩選出預測分數(shù)較高的 3條 9肽 (見表 1)。

表 1 抗原表位生物信息學預測結果Tab.1 Prediction of HLA peptides motif

1.3 多肽合成

根據生物信息學軟件篩選結果,合成 3條HLA-A＊0201限制性 9肽 (P1,P2,P3)以及與煙曲霉無關的對照肽 (來源于血液腫瘤抗原核仁磷蛋白 NPM1,CLAVEEVSL)。4條多肽交予上海強耀生物科技有限公司 (ChinaPeptides Co.,Ltd.)合成,高效液相色譜儀 (HPLC)測定其純度 >95%。1 mg多肽溶解在 20μL的 DMSO(sigma)中,每支EP管 5μL分裝,-30℃冷凍保存。

1.4 HLA-A＊0201轉基因小鼠 DC的制備

HLA-A＊0201轉基因小鼠經脫頸椎處死,浸入75%酒精中。5 min后,在生物安全柜內無菌操作游離脛骨,置于無菌 PBS中。剪掉骨兩端,使用RPMI 1640完全培養(yǎng)液 (Hyclone,含 10%胎牛血清,青霉素 100 U/mL,鏈霉素 100μg/mL,Gibco)反復沖洗骨髓腔,將獲得的細胞懸液置于 RPMI 1640完全培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱 (Thermo)孵育。4 h后輕柔吸去懸浮未貼壁的細胞,以RPMI 1640完全培養(yǎng)液輕柔沖洗 3遍,以除去未貼壁細胞。更換新的 RPMI 1640完全培養(yǎng)液,同時加入細胞因子 GM-CSF(R＆D,終濃度 20 ng/mL)和IL-4(R＆D,終濃度 10 ng/mL)。第 4天,全量更換1次 RPMI 1640完全培養(yǎng)液。第 5天,向培養(yǎng)體系加入 TNF-α(R＆D,終濃度 10 ng/mL)。第 7天 ,收獲培養(yǎng)體系內的細胞。

1.5 成熟 DC的表型鑒定

收集培養(yǎng)第 7天的 DC,調整細胞濃度至 1×107/mL,與以下抗體孵育:FITC-Anti Mouse I-Ab(AF6-120.1),PE-Anti Mouse CD80(16-10A1);FITC-Anti Mouse CD11c(N418),PE-Anti Mouse CD86(GL-1)。對照抗體分別為:FITC-Mouse Ig2a κIsotype Ctrl(MOPC-173),PE-Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl(HTK-888),FITC-Armenian Hamster IgGIsotype Ctrl(HTK-888),PE-Rat IgG2aκI-sotype Ctrl(RTK2758),全部抗體均購置美國 Biolegend公司。將 100μL細胞 (106)與熒光單抗于4℃反應 30 min,PBS洗 3次后流式細胞儀 (BD,LSR)檢測表型。

1.6 成熟 DC的抗原肽負載

成熟 DC分為兩組,分別加入 DMSO溶解的實驗組多肽和對照肽組多肽,使其濃度皆為 50μg/mL,37℃,5%CO2條件培養(yǎng) 2 h,用無血清的 RMPI 1640培基洗滌 3次后,顯微鏡下計數(shù),以 25 Gy放射當量輻照細胞,作為體外刺激 T細胞的抗原提呈細胞 (Antigen Presenting Cell,APC)備用。

1.7 抗原肽預先免疫的小鼠淋巴結細胞懸液的制備

初次免疫,無菌條件下將 1 mg實驗組多肽抗原 (P1、P2、P3以 1∶1∶1的比例混合)以及對照肽分別溶于 10μL DMSO中,再溶于 0.5 mL PBS中,與 0.5 mL弗氏完全佐劑 (CFA;Sigma,St.Louis,MO)完全混勻。75%酒精棉球消毒 HLA-A＊0201轉基因小鼠尾根部,尾根部左右兩側皮下分別注入抗原肽與弗氏佐劑混勻物約 50μL。

加強免疫,無菌條件下將 1 mg實驗組多肽抗原以及對照肽分別溶于 10μL DMSO中,再溶于 0.5 mL PBS中,與 0.5 mL弗氏不完全佐劑 (IFA;Sigma,St.Louis,MO)完全混勻。初次免疫后 10～14 d,實施再次免疫。用 75%酒精棉球消毒其尾根部,在其尾根部左右兩側皮下分別注入抗原肽與弗氏佐劑混勻物約 50μL。

再次免疫后 7～10 d后,將小鼠經脫頸椎處死,浸入 75%酒精中。10 min后,在超凈臺內小心取出已經腫大的腹股溝淋巴結 (左右各 1個),置于 RPMI 1640培養(yǎng)液中備用。收集齊所有小鼠腹股溝淋巴結后,每組分別置于 150目篩網上,以 5 mL注射器活塞研磨,研磨過程中不時用培養(yǎng)液沖洗篩網,獲得單細胞懸液。以 1640培養(yǎng)液,400 g,離心 10 min,調細胞濃度為 1×106/mL備用。

1.8 抗原肽特異性 CD8+CTL的制備

將輻照后的 DC與貼壁 4 h后的淋巴結細胞懸液中未貼壁細胞以 1∶10的比例混合均勻,RPMI 1640完全培養(yǎng)液,開始第一輪體外活化。5 d后換液,另外添加 IL-2(R＆D,終濃度 10 ng/mL),5 d后再次加入新制備的輻照后的 DC,開始第二輪的刺激。經過 3～4輪的體外刺激,并進一步使用紅細胞裂解,死細胞去除試劑盒 (Dead Cell Removal Kit,Miltenyi Biotec,Germany),免疫磁珠負性分選CD8+T淋巴細胞 (CD8+TCell Isolation Kit,Miltenyi Biotec,Germany)得到純度較高的抗原肽特異性T淋巴細胞群 (另文發(fā)表)。

1.9 抗原肽特異性 CD8+CTL的 Tetramer流式細胞儀檢測

由荷蘭 Sanquin公司設計并合成 P1,P2,P3表位特異性 PE-Tetramer。取 6組分選后的 CD8+CTL,每組 2 mL,細胞濃度為 1×106/mL。取其中3組作為實驗組,300 g,10 min離心后,吸棄上清,加入 40μL含 0.5%胎牛血清的 PBS,分別與10 μL的 P1-PE-Tetramer、P2-PE-Tetramer、P3-PETetramer混合,在 18～25℃條件下孵育 20 min;再分別與 APC anti-mouse CD8a(clone 53-6.7,Biolegend)2μL混合,4℃條件下孵育 30 min。3個對照組的染色抗體為 APC-Rat IgG2a,κIsotype Ctrl(clone RTK2758,Biolegend)2μL混合,4℃條件下孵育 30 min。PBS洗滌 3遍后,300 g,10 min離心,各組皆調濃度 1×106/mL,4℃保存,流式細胞儀檢測表型。

1.1 0 ELISPOT技術檢測 CD8+CTL對特異性抗原刺激的反應

所用試劑盒為Mouse IFN-γPrecoated ELISPOT kit(達科為生物技術有限公司)。實驗分組:APHA(sigma)陽性對照組 +抗原肽特異性 CD8+CTL;B-抗原肽特異性 CD8+CTL;C-抗原肽負載的樹突狀細胞 +抗原肽特異性 CD8+CTL;D-對照肽負載的樹突狀細胞 +對照肽特異性 CD8+CTL;E-空白樹突狀細胞 +抗原肽特異性 CD8+CTL;F-空白樹突狀細胞 +對照肽特異性 CD8+CTL。具體操作見參考文獻[9]。

2 結 果

2.1 煙曲霉特異性抗原肽的生物信息學預測

在前期工作基礎上,我們使用由美國國家生物技術中心和德國 Tubingen大學免疫系提供的生物信息學軟件掃描了位于煙曲霉細胞壁的抗原 Asp f16的全部 427個氨基酸序列[16]。鑒于國人最常見的 HLA位點是 HLA-A＊0201,我們選擇了該位點作為靶點,并根據與 HLA分子穩(wěn)定性半衰期評分篩選并合成了 3條 9肽 (見表 1)。

2.2 體外培養(yǎng)小鼠骨髓造血干細胞來源的 DC及成熟 DC的表型鑒定

貼壁細胞在 mGM-CSF和 mIL-4培養(yǎng) 3 d時,DC數(shù)量明顯增多,并有部分細胞懸浮,懸浮細胞有小的突起,出現(xiàn)大量半貼壁半懸浮的集落,集落表面的細胞有小的突起。第 4天,細胞增加更多,表面出現(xiàn)長長的樹枝狀突起。第 5天加入 TNF-α促使其成熟,至第 7天培養(yǎng)液中的大部分細胞已經基本成熟,成較大的圓球形,表面有刺狀突起。培養(yǎng) 7 d的 DC,經過 4種熒光抗體的標記之后,顯示表達各種標記抗體對應的表面分子細胞數(shù)量百分比為:MHCⅡ-32.80%,CD80-52.39%,CD11c-55.38%,CD86-43.15%,表明所培養(yǎng)的樹突細胞已經達到相當程度的表型成熟。證實我們建立了穩(wěn)定的樹突狀細胞的體外培養(yǎng)和誘導成熟體系 (見圖 1)。

2.3 體外檢測抗原肽特異性 CTL的研究

預先皮下免疫獲得的引流淋巴結來源的 T細胞,經過 APC(負載抗原肽的樹突狀細胞)體外 2～4輪的刺激:第一輪前 5 d不加細胞因子 IL-2,目的是確保非特異性 T細胞死亡,以提高抗原特異性T細胞的純度;從第二輪開始,細胞快速增殖,每隔1 d就要傳代;至第 3～4周特異性 CTL達到一定純度,經過溶紅、去死、CD8陰選一系列處理之后,以 PE標記的 P1、P2、P3特異性四聚體和 APC標記的 CD8a熒光抗體共同染色。結果表明,CD8分子陽性率為 90%以上。Tetramer實驗顯示 P1、P2、P3的陽性表達率即 3種 9肽特異性 CTL所占的比率分別為 10.66%,7.29%,5.03%(見圖 4)。因此,我們應用 Tetramer實驗證實了煙曲霉 3種抗原肽與 HLA-A＊0201分子的親和力 (見圖 2)。

2.4 ELISPOT煙曲霉特異性抗原肽體外活化 T細胞的研究

我們應用 ELISPOT實驗驗證生物信息學預測的煙曲霉抗原多肽體外可以活化 CTL并產生細胞因子 IFN-γ?？乖岢始毎c CD8+CTL經過 20 h的作用,不同分組孔內產生細胞因子 IFN-γ的 T細胞的數(shù)量不同:①陽性對照組在低濃度絲裂原PHA的刺激下,一部分煙曲霉肽特異性 CTL分泌IFN-γ。②無 APC的刺激時,煙曲霉肽特異性 CTL幾乎不分泌 IFN-γ,細胞數(shù)僅為 (4.0±3.6)spots/well。③在特異性 APC的刺激下,數(shù)量很多的煙曲霉肽特異性 CTL分泌 IFN-γ,高達 (266.0±39.2)spots/well。④在對照肽負載 DC刺激下,數(shù)量很多的對照肽特異性 CTL分泌 IFN-γ。⑤非抗原負載DC刺激下,很少數(shù)目的煙曲霉肽特異性 CTL分泌IFN-γ。⑥非抗原負載 DC刺激下,很少數(shù)目的對照肽特異性 CTL分泌 IFN-γ。具體數(shù)值見圖 2。這些結果表明煙曲霉抗原肽和對照肽體外可以活化相應的 CD8+CTL并產生 IFN-γ(見圖 3)。

3 討 論

IA是一種主要由煙曲霉引起,通常侵犯免疫力受損人群的破壞性和致死率極高的惡性感染,病情的發(fā)展和轉歸取決于煙曲霉的侵襲力和宿主的抗真菌免疫能力之間的平衡[7,8]。通常情況下,人們每天都會吸入大量煙曲霉孢子,對于免疫力正常的宿主,以中性粒細胞和巨噬細胞為代表的固有性免疫與以 T淋巴細胞為主導的特異性免疫可以迅速將侵入體內的煙曲霉完全清除,而不發(fā)病[8]。然而對于免疫受損患者,不能及時徹底清除煙曲霉這種生長繁殖非常迅速的病原真菌,一旦感染,后果十分嚴重。

圖 1 小鼠骨髓來源的樹突狀細胞體外表型。小鼠骨髓來源的樹突狀細胞在添加了細胞因子 rmGM-CSF(20 ng/mL)和 rmIL-4(10 ng/mL)的R10培養(yǎng)基中孵育。第 5天,加入 rmTNF-alpha(10 ng/mL),第 7天,收獲樹突狀細胞,染色,流式細胞儀分析 圖 2 Tetramer實驗檢測Asp f16多肽特異性 T細胞。Asp f16多肽特異性CD8+T細胞 (1×106/mL)與 Asp f16特異性 tetramer,APC熒光標記的抗鼠 CD8a單克隆抗體 4℃染色 30 min,然后進行流式細胞儀分析 圖 3 ELISPOT實驗檢測 CD8+CTL特異性 IFN-γ的釋放。5×103樹突狀細胞與 25μg/mL Asp f16多肽混合物或者對照肽37℃孵育 2 h,然后與 5×104同源的CTL共孵育 20 h。使用PHA作為陽性對照,每一個柱狀圖代表 3次實驗的標準值 ±SD。A-PHA刺激 Asp f16多肽特異性 CTL;B-Asp f16多肽特異性 CTL;C-Asp f16多肽負載的樹突狀細胞活化Asp f16多肽特異性CTL;D-對照肽負載的樹突狀細胞活化對照肽特異性CTL;E-無多肽負載的樹突狀細胞活化 Asp f16多肽特異性 CTL;F-無多肽負載的樹突狀細胞活化對照肽特異性CTLFig.1 Phenotypes of the in vitro generated murine dendritic cells derived from bone marrow.The DCswerecultured in the R10medium supplemented with rmGM-CSF(20 ng/mL)and rmIL-4(10 ng/mL).On day 5,rmTNF-alpha(10 ng/mL)was added in and the DCs were harvested and analyzed by flow cytometry on day 7 Fig.2 Tetramerbased detection of Asp f16 peptides-specific T cells.Asp f16 peptidespecific CD8+Tcells(1×106/mL)were stained with Asp f16-specific tetramers and APC-labeled anti-mouse CD8amonoclonal antibody at 4℃for 30 minites.The cells were then analyzed by flow cytometry Fig.3 Specific IFN-γrelease by in vitro-stimulated CD8+CTL measured by ELISPOT.Dendritic cells(5×103)were incubated with 25μg/mL of Asp f16 peptides mixtures or control peptide at 37℃for 2 hours and then co-cultured with 5×104 autologous CTLs in each well for 20 hours.PHA was used as positive control in all assays.Each value was represented as the mean±SD.A-PHA stimulated Asp f16 peptides specific CTLs;B-Asp f16 peptides specific CTLs alone;C-Asp f16 peptides loaded DCs plus Asp f16 peptides specific CTLs;D-Control peptide loaded DCs plus control peptide specific CTLs;E-Peptide unloaded DCs plus Asp f16 peptides specific CTLs;F-Peptide unloaded DCs plus control peptide specific T cells

流行病學研究表明 IA的發(fā)病人群構成主要是造血干細胞移植患者、移植物抗宿主病患者、實體器官移植患者、腫瘤化療患者、HIV感染者等,這類患者常常伴有嚴重的 T細胞免疫功能缺陷[1-5]。國內外大量研究也表明 T細胞免疫在宿主清除煙曲霉感染中具有重要作用,研究者發(fā)現(xiàn)通過過繼轉移煙曲霉培養(yǎng)粗提物抗原活化的小鼠 T細胞,能顯著增加后繼靜脈內給予煙曲霉孢子的小鼠的存活率,從而證實了煙曲霉特異性 T細胞具有免疫治療作用[7,9-11]。因此,體外建立供體來源的煙曲霉特異性 T細胞克隆,在受體對 IA易感時期 (例如:HSCT后早期,預防及治療 GVHD時),過繼轉移給受體,可以建立受體針對煙曲霉的特異性免疫反應能力,從而保護受體免于發(fā)病或者增強其對治療的反應性,免疫治療 IA具有重要意義和廣闊的應用前景[12-14]。

但是,我們的前期工作結果顯示煙曲霉孢子的免疫原性較差,獲得的煙曲霉特異性分泌 IFN-γ的Th1細胞絕對值較低,與國內外的研究結果較一致[7,17]。目前的多數(shù)研究使用煙曲霉孢子、菌絲或者煙曲霉胞壁蛋白粗提物作為抗原,除了含有相關的特異性抗原外,還包括大量的非相關抗原成分,包括糖類、蛋白質、核酸甚至毒素[6,10-14,17]。它的主要缺點是抗原為混合物,純度低,且免疫原性不強,不適合臨床應用,甚至危及患者生命。因此,篩選和鑒定合適的煙曲霉抗原表位,成為提高過繼免疫治療 IA療效的關鍵問題。

研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉重組過敏原 Asp f16(編碼基因crf1,GenBank entry AJ223327,Genomic locus Afu1g16190)可以引起顯著的 T細胞免疫應答[18,19]。研究者使用 Asp f16抗原作為疫苗免疫小鼠,誘導保護性 T細胞應答,增加了小鼠對抗肺煙曲霉感染的能力和存活時間[20]。據此,本研究根據煙曲霉抗原 Asp f16的氨基酸全序列信息,利用生物信息學軟件,以我國漢族人群常見的限制性位點 HLA-A＊0201為靶點篩選合成 3條 HLA-I限制的 9肽,誘導產生煙曲霉特異性的 CTL,并進行實驗室鑒定[16]。篩選和鑒定已知氨基酸序列抗原的 T細胞表位通常采用全長序列范圍內的基序預測法和肽段重疊法,本研究采用基序預測法通過生物信息學軟件預測煙曲霉抗原表位,與肽段重疊法相比較,可節(jié)省大量人力物力,可以作為一個快速高效篩選合適抗原肽的工作平臺。

本研究建立了轉人基因 HLA-A＊0201小鼠 DC培養(yǎng),誘導成熟,抗原遞呈,以及 CTL體外擴增體系,為進一步在實驗動物體內模擬了人體發(fā)病和免疫應答反應的過程,評估多肽特異性 CTL在免疫治療 IA的作用和 CTL殺傷煙曲霉的機制研究奠定基礎。選擇轉人基因 HLA-A＊0201小鼠作為研究對象,將合成的生物信息學預測得到的煙曲霉Asp f16抗原肽預先皮下免疫 HLA-A＊0201轉基因小鼠,可以模擬體內免疫環(huán)境,獲得的引流淋巴結來源的 T細胞,使免疫反應最大化和最優(yōu)化[15]。通過已有的技術平臺,體外負載成熟的樹突狀細胞,由其加工、遞呈給 T細胞,在體外制備煙曲霉多肽特異性 CTL[7]。MHC-四聚體試驗證實了生物信息學預測的抗原表位與 HLA-A＊0201分子具有很強的的結合能力。ELISPOT試驗證實生物信息學預測的煙曲霉 Asp f16的抗原肽可以活化 T細胞,并釋放大量 IFN-γ。因此,本研究通過生物信息學預測的 3個抗原肽,經實驗室鑒定為煙曲霉抗原Asp f16的 HLA-A＊0201限制性 CD8+CTL的抗原表位,可作為今后設計抗煙曲霉多表位肽疫苗的備選肽,并為進一步研究 CTL殺傷煙曲霉機制和免疫治療 IA提供參考。

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