史 偉,黃仁發(fā),藍 芳,陳延強

(1.廣西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,廣西 南寧 530023;2.廣西中醫(yī)學院附屬瑞康醫(yī)院,廣西 南寧 530011)

加味附子理中免煎顆粒對急性馬兜鈴酸腎病大鼠抗氧化作用的研究*

史 偉1,黃仁發(fā)2,藍 芳1,陳延強1

(1.廣西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,廣西 南寧 530023;2.廣西中醫(yī)學院附屬瑞康醫(yī)院,廣西 南寧 530011)

目的：觀察加味附子理中免煎顆粒對急性馬兜鈴酸腎病大鼠的抗氧化作用。方法：在應用馬兜鈴酸A純品灌胃致急性馬兜鈴酸腎病大鼠模型上,觀察加味附子理中免煎顆粒對急性馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織SOD、MDA水平的變化及腎臟病理改變。結(jié)果：中藥組可增加急性馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織SOD、降低MDA的表達,中藥和強的松聯(lián)合處理后較其他組更能明顯增加急性馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織SOD、降低MDA的表達(P＜0.01),減輕腎臟病理損害。結(jié)論：加味附子理中免煎顆粒聯(lián)合強的松治療可以改善大鼠腎臟的氧化應激,減輕腎臟病理損害。

加味附子理中湯;馬兜鈴酸腎病;超氧化物歧化酶;丙二醛

急性馬兜鈴酸腎病為一次或短期大量服用馬兜鈴酸(Aristolochic acid,AA)所致,病理表現(xiàn)為腎小管壞死或腎小管上皮細胞凋亡。目前認為,細胞凋亡是急性腎衰竭(Acute renal failure,ARF)時腎小管上皮細胞死亡的重要形式[1],細胞凋亡在AA引起的腎毒性損害中扮演了關(guān)鍵的角色[2],而氧化活性氧族可以使腎小管上皮細胞受損,可以導致腎小管上皮細胞凋亡[3]。筆者前期臨床研究表明,加味附子理中免煎顆粒能有效改善馬兜鈴酸腎病(Aristolochic acid nephropathy,AAN)患者腎功能[4],本實驗通過觀察加味附子理中免煎顆粒對急性馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平的影響及腎臟病理改變,探討其對腎臟的保護機制,為臨床應用加味附子理中免煎顆粒治療急性馬兜鈴酸腎病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 清潔級 SD大鼠 90只,雌雄各半,體重(250±20)g,購自上海斯萊克景達實驗動物有限公司長沙分公司(動物合格證號：SCXK(湘)2009-0004)。

1.2 藥品與試劑 加味附子理中免煎顆粒(制附子8 g,干姜6 g,人參12 g,黃芪15 g,當歸10 g,白術(shù)15 g,茯苓12 g,法半夏6 g,炙甘草6 g),由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn);醋酸潑尼松片,廣東阿特維斯(佛山)制藥有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品批號：0810535;馬兜鈴酸A化學對照品,中國藥品生物制品檢定所提供;SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗鼠多克隆SOD抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司);兔抗鼠多克隆MDA抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 實驗分組及造模、給藥方法 將90只大鼠按完全隨機的方法分為5組,模型組、中藥組、強的松組、中藥+強的松組(各組均為20只)、正常組10只,予馬兜鈴酸A純品100 mg/kg?d,連續(xù)灌胃3 d建立模型,正常組：給予生理鹽水灌胃,自由飲食3周。模型組：給予蒸餾水灌胃,自由飲食3周。中藥組：給予加味附子理中免煎顆粒(10 mL?kg-1?d-1)灌胃,自由飲食3周。強的松組：給予強的松片治療(0.5 mg?kg-1?d-1)灌胃,自由飲食3周。中藥+強的松組：給予加味附子理中免煎顆粒(10 mL?kg-1?d-1)及強的松片(0.5 mg?kg-1?d-1)灌胃,自由飲食3周。

2.2 處理及指標觀察 實驗第3周結(jié)束時將大鼠行過量麻醉處死,剖腹,分離腎臟,將雙腎剝離干凈,置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中,固定 24 h后,常規(guī)石蠟包埋、切片,行 HE染色。按免疫組化試劑盒程序進行檢測腎組織SOD和MDA的表達。陽性表達部位呈棕黃色深染;CMLAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析,10×20倍視野下通過測量SOD、MDA陽性表達的平均光密度(Mean optical density,M OD)反映其陽性程度。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0軟件包,數(shù)據(jù)以(±s)表示,組內(nèi)均數(shù)用配對t檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析;組間均數(shù)兩兩比較采用q檢驗。

3 結(jié)果

3.1 光鏡下HE染色結(jié)果 光學顯微鏡所見,正常組腎臟結(jié)構(gòu)清楚,腎小球及腎小管無病理改變;模型組腎小球未見明顯病變,但腎小管可見壞死、鈣化、刷狀緣丟失、小管擴張、管腔管型等病理改變,間質(zhì)可見大量的炎癥細胞浸潤,并可見少量的肌成纖維細胞;中藥組腎小球也未見明顯病理改變,腎小管間質(zhì)可見壞死、刷狀緣丟失、小管擴張、管腔管型、小管間質(zhì)炎癥細胞浸潤等病理改變,與模型組相比較,病理改變無明顯改善;強的松組腎小球也未見明顯病理改變,腎小管也可見上述等病理改變,但比模型組稍改善;中藥+強的松組大鼠小管結(jié)構(gòu)較模型組明顯完整清晰,管腔內(nèi)容物較模型組明顯減少,炎癥細胞浸潤也明顯減輕,病理改變明顯減輕。

3.2 各組腎組織MDA、SOD含量比較

表1 免疫組化半定量分析后SO D、MDA平均光密度的含量表達(MOD×10-2)

由上表可知,模型組與正常組比較,SOD陽性細胞表達明顯減少,MDA明顯增加(P＜0.01);中藥組較模型組SOD陽性細胞數(shù)增加,MDA減少(P＜0.01);強的松組大鼠腎小管及間質(zhì) SOD較中藥組有所增多,而 MDA減少(P＜0.01);中藥+強的松組大鼠SOD最多,而 MDA較強的松組明顯減少(P＜0.01)。以上結(jié)果提示單純中藥處理可以增加腎小管和間質(zhì)SOD的表達,降低MDA表達,較強的松組效果欠佳,但中藥和強的松聯(lián)合處理后卻能明顯增加SOD的表達,明顯降低MDA表達,可以更好發(fā)揮保護腎臟作用。

3 討論

MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,含量增高時,引起明顯的組織或細胞損傷,而SOD是組織自身產(chǎn)生的抗氧化酶,對組織或細胞具有保護作用,MDA、SOD活性高低可間接反映機體清除自由基的能力。由于體內(nèi)外各種因素刺激,常引起體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性降低、丙二醛(MDA)增高,氧自由基清除減少,導致氧自由基增多。體內(nèi)代謝或外源性因素產(chǎn)生的自由基均被證實可誘導細胞凋亡[5]。已有研究顯示,A RF時血清和腎組織中SOD活性降低、MDA增高,表明氧自由基參入了ARF的發(fā)病過程[6]。

筆者的實驗結(jié)果顯示,加味附子理中免煎顆?？商岣吣I組織SOD活性,降低MDA水平,減輕腎臟病理損害,聯(lián)合使用強的松后提高腎組織SOD活性,降低MDA水平作用更明顯。加味附子理中免煎顆粒組方主要由制附子、干姜、人參、黃芪、當歸、白術(shù)、茯苓、法半夏、炙甘草共同組成,在既往的研究及本次實驗中,急性馬兜鈴酸腎病大鼠均出現(xiàn)了畏寒聚堆、活動減少、精神萎靡、反應遲鈍、大便溏爛等陽虛的癥狀,而組方中附子大辛大熱,功善回陽救逆、補火助陽,主治一切陽虛陰盛之證,用來治療馬兜鈴屬藥物所致的中毒病證,配合辛熱的干姜增強溫中祛寒扶助脾陽作用,為君藥;人參,黃芪甘溫益氣健脾,使氣旺而陽亦復,是臣藥;白術(shù)、炙甘草健脾益氣和中,共為佐使藥;加茯苓、法半夏可調(diào)理中焦、健脾和胃,使中焦脾胃的升清降濁功能得到恢復,諸藥配伍,具有溫陽祛寒、益氣健脾作用,可以使馬兜鈴酸腎病者受損之脾陽得到恢復,從而減輕其一系列臨床癥狀。同時,現(xiàn)代藥理及實驗研究亦表明：附子可提高 SOD活性、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化[7],人參中主要成分人參總皂苷具有降低脂質(zhì)過氧化反應,清除自由基,保護血管內(nèi)皮細胞等作用[8]。黃芪具有增強SOD活性、減輕脂質(zhì)過氧化,改善腎組織結(jié)構(gòu),保護腎臟功能的作用[9]。當歸中當歸多糖可明顯升高血瘀證大鼠心、腦、腎、胰四臟器SOD活性,降低MDA含量,具有抗氧化效應;對超氧陰離子自由基和羥自由基均有良好的清除能力[10～11];白術(shù)亦能顯著提高大鼠腎皮質(zhì)中SOD的含量[12]。實驗提示加味附子理中免煎顆粒對腎臟的保護作用可能主要與其保護抗氧化酶的活性、清除氧自由基、抑制體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應、提高機體的抗氧化能力有關(guān)。

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Study on the Antioxidant Effect of Flavored Fried-free Aconite Particles on Acute Aristolochic Acid Nephropathy Rats

SHI Wei,H UANG Ren-fa,LAN Fang,et al
(Department of Nephrology,First Affiliated Hospital,Guangxi Traditional Chinese Medical College,Nanning,Guangxi,530023)

Objective：To observe the antioxidant effect of flavored fried-free aconite particles on acute aristolochic acid nephropathy rats.Methods：Pure aristolochic acid A was used to induce acute aristolochic acid nephropathy rat models to observe the changes of SOD、MDA levels and the renal pathological changes of the acute aristolochic acid-induced nephropathy rats.Results：The Chinese herbal medicine group could increase SOD of the renal tissue and reduce the expression of MDA of the acute aristolochic acid-induced nephropathy rats.The Chinese herbal medicine group combined with prednisone significantly increased more SOD of the renal tissue and lower more MDA expression(P ＜0.01)than other groups and reduced the renal pathological damage.Conclusion：The flavored fried-free aconite particles combined with prednisone can improve the oxidative stress in rat kidneys and reduce the renal pathological damage.

flavored fried-free aconite particles;aristolochic acid nephropathy;superoxide dismutase;malondialdehyde

R285

A

1007-2349(2011)07-0061-03

廣西科學基金資助項目(編號：桂科自0832173)

史偉(1960～),女,廣西融安人,主任醫(yī)師,碩士研究生導師,主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治腎病、風濕病的研究工作。

2011-01-24)