李會(huì)娟， 張 寧*， 李秋紅， 王業(yè)秋， 王發(fā)善， 陳巧云

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040;2.多多藥業(yè)有限公司，黑龍江佳木斯 154007)

逍遙散源于《太平惠民和劑局方》，具有疏肝解郁、調(diào)和氣血的功效，是治療肝郁脾虛的常用方劑［1］。逍遙散在臨床上廣泛應(yīng)用于婦科、肝膽病、胃腸病、神經(jīng)官能癥、心腦血管病及糖尿病、腫瘤等軀體疾病繼發(fā)的抑郁狀態(tài)［2-3］。吳麗麗等［4］、張崇燕等［5］采用自主活動(dòng)、小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳等方法均證明逍遙散有明顯的抗抑郁作用，丁國(guó)安等［6］臨床觀察逍遙散加味聯(lián)合米氮平治療產(chǎn)后抑郁癥，效果良好，不良反應(yīng)少。

逍遙散由八味藥組方，其成分復(fù)雜，目前主要采用HPLC測(cè)定芍藥苷、阿魏酸、甘草甜素等少數(shù)成分的方法［7］，對(duì)逍遙散及其成方制劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，這不能全面反映其內(nèi)在質(zhì)量，需要一種全面、簡(jiǎn)單易行的方法來(lái)評(píng)價(jià)逍遙散的質(zhì)量。指紋圖譜能較全面地反映出組方中的成分［8］，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC對(duì)逍遙散進(jìn)行指紋圖譜的研究，建立逍遙散指紋圖譜的共有模式，以實(shí)現(xiàn)多成分評(píng)價(jià)逍遙散及其成方制劑的質(zhì)量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 series液相(G1322A Degasser，G1311A Quat Pump，G1329A ALS，G1316A TCC，G1315D DAD);Venusil XBP C18(天津博納艾杰爾科技有限公司)色譜柱;BT224S萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯);KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004 A);中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 藥材與試劑 乙腈(色譜純;Burdick＆Jackson.);娃哈哈純凈水;甲醇、磷酸為分析純。逍遙散遵照《太平惠民和劑局方》并結(jié)合臨床用量，確定組方:柴胡 30 g、白芍 30 g、當(dāng)歸 30 g、白術(shù) 30 g、茯苓30 g、甘草 15 g、薄荷10 g、炮姜 10 g，自制而成。以上藥材均購(gòu)自北京同仁堂制藥集團(tuán)哈爾濱藥店，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院陳孝忠副教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 逍遙散 取10批逍遙散組方藥材，粉碎，過(guò)2號(hào)篩，按組方比例混合。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 準(zhǔn)確稱(chēng)取逍遙散 1.85 g，加甲醇 20 mL，超聲提取兩次(30 min，15 min)，合并濾液，蒸干，用甲醇定容為10 mL，溶液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.2.2 以逍遙散1.85 g計(jì)，按組方比例稱(chēng)取逍遙散各單味藥，提取方法同上。

2.3 色譜條件的確立

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 190 nm～400 nm全波長(zhǎng)掃描，經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn)280 nm處基線平穩(wěn)，出峰多，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

2.3.2 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液4種流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫時(shí)峰的分離度和峰形都比較好，所以選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動(dòng)相。梯度見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度Tab.1 The gradient of mobile phase

2.3.3 色譜柱的考察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了依利特ODS-2C18、依利特 ODS-C18、Thermo ODS-2C18、Venusil XBP C18色譜柱，比較后發(fā)現(xiàn)，Venusil XBP C18色譜柱出峰多，分離度好，故選擇Venusil XBP C18色譜柱進(jìn)行逍遙散的成分研究。

2.3.4 色譜條件的確立 根據(jù)上述結(jié)果，最終確立的色譜條件為:色譜柱Venusil XBP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫 35 ℃;體積流量 1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度見(jiàn)表1。在上述色譜條件下，取供試品溶液進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 逍遙散的指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of Xiaoyao Powder

2.4 共有峰的確定 按照2.1項(xiàng)制備逍遙散樣品10批，用2.3.4項(xiàng)下色譜條件測(cè)定了10批逍遙散的指紋圖譜，采用國(guó)家藥典委員會(huì)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(版本2004 A)，確定22個(gè)共有峰(見(jiàn)圖2，表2)，其相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%。

2.5 參照峰的選擇 保留時(shí)間為40.6 min的色譜峰，峰面積較大，出峰時(shí)間適中且穩(wěn)定，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照認(rèn)定為甘草苷的吸收峰(見(jiàn)圖3)，因此選擇甘草苷作為參照物。

2.6 方法學(xué)考察

圖2 10批逍遙散的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 10 batches of Xiaoyao Powder

圖3 甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品與逍遙散樣品對(duì)照色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of liquiritin and Xiaoyao Powder sample

表2 10批樣品出峰數(shù)目及共有峰所占比例Tab.2 The peak number of 10 batches of Xiaoyao Powder and the proportion of common peaks

2.6.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試液相同條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于1%，符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按2.1項(xiàng)制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，符合指紋圖譜要求，重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試液分別在0、4、8、16、24 h進(jìn)樣，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，說(shuō)明供試樣品在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 相似度計(jì)算 采用國(guó)家藥典委員會(huì)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(版本2004 A)，對(duì)10批逍遙散的指紋圖譜進(jìn)行分析，以色譜峰的平均值建立對(duì)照指紋圖譜，利用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算指紋圖譜的相似度，均不小于0.99，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 逍遙散10批相似度計(jì)算結(jié)果(S:共有模式)Tab.3 Similarity caculations of 10 batches of Xiaoyao Powder(S:the common pattern of Xiaoyao Powder)

2.8 共有峰歸屬認(rèn)定 利用平均值生成逍遙散的共有模式(見(jiàn)圖4)。以逍遙散比例按2.2項(xiàng)下制備逍遙散各單味藥及其陰性對(duì)照組方的樣品，用2.2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣生成指紋圖譜，以保留時(shí)間和光譜確認(rèn)各共有峰的來(lái)源(見(jiàn)圖4)。來(lái)源于白芍的是:2、3、5、6、12 號(hào)峰，來(lái)源于當(dāng)歸的是:1、2、4、5、6、8、9、11、14、20、22 號(hào)峰，來(lái)源于甘草的是 6、7、10、16、18號(hào)峰，來(lái)源于薄荷的是 13、15、17 號(hào)峰，來(lái)源于炮姜的是19、22號(hào)峰，其中2、5號(hào)峰是白芍和當(dāng)歸共有成分，6號(hào)峰是白芍、當(dāng)歸和甘草共有成分，22號(hào)峰為當(dāng)歸和炮姜的共有成分。21號(hào)峰在單味藥中未找出其來(lái)源，可能是在樣品制備過(guò)程中藥物相互作用產(chǎn)生的新成分。在逍遙散的八味藥中柴胡、茯苓、白術(shù)沒(méi)有色譜峰顯示在共有模式中。

圖4 逍遙散與單味藥對(duì)照色譜圖和各共有峰紫外光譜圖(x軸:nm，y軸:mAU)Fig.4 HPLC chromatogram of Xiaoyao Powder and single Chinese medicine and UV spectrum of common peaks

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)建立了逍遙散的HPLC指紋圖譜，采用國(guó)家藥典委員會(huì)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(版本2004 A)，生成了逍遙散指紋圖譜的共有模式，確定了22個(gè)共有峰，計(jì)算了10批逍遙散的指紋圖譜的相似度，均在0.99以上，且各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，這說(shuō)明本試驗(yàn)方法所建立的指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性和可控性，可以從整體定性評(píng)價(jià)逍遙散的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)明確了22個(gè)共有峰的生藥歸屬，為逍遙散的定量指標(biāo)的選擇和確定提供了參考。

3.2 中藥復(fù)方是中醫(yī)藥應(yīng)用于臨床的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，傳統(tǒng)研究的水平限制了中藥復(fù)方的發(fā)展。中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚，藥效不明確阻礙了中藥復(fù)方走向世界。逍遙散是臨床常用的經(jīng)典方劑，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確。楊玉興等［9］對(duì)肝郁脾虛患者口服加味逍遙散后阿魏酸的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，但單成分不能完全闡述逍遙散的藥效作用機(jī)制。指紋圖譜技術(shù)是量化表達(dá)和解析中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)整體特征的重要手段［10］，本實(shí)驗(yàn)指紋圖譜技術(shù)所建立的逍遙散體外全成分分析方法，為逍遙散體內(nèi)成分研究、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的確定以及配伍規(guī)律的解析等奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。

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