高晶晶， 李穩(wěn)宏， 李婉婷， 蔡 靜， 趙 鵬， 延綏宏， 朱驟海

(西北大學化工學院，陜西西安 710069)

款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfara的干燥花蕾，又名冬花、九九花等。它是應用歷史悠久的中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品［1］，臨床上主要用于新久咳嗽，喘咳痰多，勞嗽咳血等癥［2］。最新研究表明款冬花粗多糖對體外培養(yǎng)人白血病K562細胞有顯著的凋亡誘導作用，在治療白血病方面具有良好前景［3］。而目前對款冬花多糖深入研究報道較少，為此作者在這方面進行了一定的研究。

對款冬花多糖的脫色是其分離純化工藝中一個重要的環(huán)節(jié)。目前提取的款冬花多糖顏色一般較深，必須對其中的色素進行脫除。多糖脫色的常用方法有活性炭法、雙氧水法以及樹脂法等［4］，本實驗對這幾種常用的方法進行了比較研究，以期得到一條適合款冬花多糖脫色的工藝路線。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑 款冬花由陜西省新藥技術開發(fā)中心提供;30%H2O2，考馬斯亮藍，十六烷基三甲基溴化銨，異辛烷，正己醇，NaCl，苯酚，硫酸等試劑均為分析純;西安市藍深樹脂公司提供 LS-21，LS-30，LS-700B，LS-206型大孔吸附樹脂;西安市藍曉樹脂公司提供LXD-762，LSA-700B型大孔吸附樹脂;722分光光度計，日本島津公司;ZHWY-200B型恒溫震蕩器，上海智城分析儀有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備款冬花多糖及脫蛋白 將款冬花干燥花蕾粉碎，加入95%的乙醇脫脂，脫脂后的款冬花加入一定量的水，用超聲輔助浸提30 min，抽濾，合并濾液濃縮，然后醇沉，抽濾，濾餅用無水乙醇、乙醚洗滌數(shù)次，干燥后即可得到黃棕色的款冬花多糖粗品。

將上述粗多糖配制成一定質(zhì)量濃度的粗多糖液，加入一定量Sevage試劑(氯仿-正丁醇為4∶1)，經(jīng)3 000 r/min均質(zhì)機充分混合后離心，取上清液再加入Sevage試劑按上述方法重復操作多次，直至蛋白脫除率達到80%以上為止。

1.2.2 款冬花多糖脫色方法簡介

方法1 雙氧水氧化法脫色:取脫蛋白后的多糖配制30 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液，調(diào)節(jié)pH為9，加入等體積30%的H2O2，置于45℃恒溫水浴中脫色6 h。

方法2 活性炭吸附脫色:活性炭用重蒸水清洗后過濾，在120℃下干燥8 h，冷卻備用。取脫蛋白后的多糖配制30 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液，向其中加入1.5%的活性炭，置于45℃恒溫水浴中，脫色2 h。

方法3 反膠束溶液脫色［5］:反膠束溶液的制備方法為準確移取2 mL正己醇、8 mL異辛烷和0.548 g十六烷基三甲基溴化銨混合。多糖預處理液的制備方法為配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL脫蛋白后粗多糖溶液100 mL，然后在沸水浴中加熱30 min，取出并冷卻至室溫，3 000 r/min下離心3 min，取其中40 mL上清液，并向其中加入0.467 g NaCl，攪拌至全部溶解，備用。最后取3 mL的多糖預處理液各向其中加入1 mL反膠束溶液，振蕩3 min，靜置30 min，取下層液體測其色素、多糖及蛋白量。

方法4 大孔吸附樹脂法脫色:按常規(guī)的樹脂預處理方法對6種樹脂進行處理，通過靜態(tài)吸附實驗，初選一個較優(yōu)的樹脂，對其進行脫色實驗。

1.3 分析方法

1.3.1 測定多糖中色素量及計算其脫色率 將款冬花粗多糖的水溶液在波長為200 nm～700 nm范圍內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)溶液在280 nm～320 nm處有一個吸收平臺，因此將色素的檢測波長定為320 nm。

A前、A后分別為脫色前后多糖樣品的吸光度值。

1.3.2 測定多糖量及計算多糖保留率 采用苯酚-硫酸法［6］測定多糖的量。

M前、M后分別為脫色前后的多糖量。

1.3.3 測定多糖中蛋白量及計算蛋白去除率采用考馬斯亮藍法［7］測定蛋白的量。C前、C后分別為脫色前后的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

2 結果與討論

2.1 不同脫色方法的結果和分析 見圖1。

圖1 不同脫色方法結果比較

由圖1可知，雙氧水脫色法的脫色率和多糖保留率均處于中等水平。其脫色原理是雙氧水在受熱過程和光照條件下會迅速分解產(chǎn)生初生態(tài)氧，這種氧會破壞多糖中的有色物質(zhì)，但其缺點是雙氧水在脫除色素的同時，它的強氧化性也會使多糖的羥基等活潑基團氧化，使多糖降解，從而降低了多糖的保留率［8］。

活性炭吸附脫色法的脫色率很高，但其缺點是多糖保留率低，是由于活性炭有很強的吸附作用，在吸附色素的同時也會吸附大量的多糖，而且采用這種方法脫色后，過濾起來也相當困難［5］。

反膠束溶液法是一種新型的脫色方法，它的優(yōu)點在于脫色的過程中不會破壞多糖，仍然可以保留大部分多糖。但是脫色效果相對于其它方法不是很明顯，而且在多糖液中加入的反膠束溶液在脫色后很難完全去除干凈，這將會對后續(xù)的純化及結構鑒定方面的研究產(chǎn)生一定的影響。

樹脂吸附脫色法是一種比較好的脫色方法，盡管其脫色率沒有活性炭法高，但多糖保留率高，并且具有較高的蛋白去除率。因此本實驗又對樹脂脫色法進行了深入的研究。

2.2 大孔吸附樹脂法脫色工藝條件優(yōu)化研究

2.2.1 靜態(tài)吸附實驗優(yōu)選脫色樹脂 將6種樹脂用常規(guī)樹脂處理方法預處理后各稱取1 g(干質(zhì)量)放入具塞錐形瓶中，分別加入100 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的粗多糖溶液，室溫下置于恒溫振蕩器中，200 r/min，每隔一定時間取樣測其色素量，最后測其多糖保留率和蛋白去除率，結果見圖2和圖3。

圖2 靜態(tài)吸附動力學曲線

圖3 不同樹脂靜態(tài)吸附脫色結果

由圖可見，LXD-762和LS-206兩種樹脂的脫色率均較高，但LXD-762的多糖保留率明顯較差。因此，選用LS-206對其脫色性能進行進一步研究。

2.2.2 動態(tài)吸附單因素實驗

2.2.2.1 上樣速度對脫色效果的影響 用濕法將處理好的20 mL樹脂(LS-206，下同)裝入玻璃交換柱，配制粗多糖液20 mL，濃度為4 mg/mL，上柱，迅速調(diào)節(jié)其體積流量為1 BV/h，然后用2 BV的蒸餾水沖洗，后測脫色液中色素的量，最后將溶液與洗液合并，測合并液的多糖和蛋白量。然后在相同的條件下對其它上柱速度1.5 BV/h、2 BV/h、2.5 BV/h、3 BV/h進行考察，每一個實驗均做兩遍，然后取其平均值，結果見圖4。

圖4 上柱體積流量對樹脂脫色的影響

由圖4可知，上柱體積流量為1 BV/h時脫色效果較優(yōu)，而且此時多糖保留率也較好，約為69%。

2.2.2.2 上樣量對脫色效果的影響 用濕法裝柱，柱體積為20 mL，配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL的粗多糖液，體積分別為 10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL，上柱，迅速調(diào)節(jié)體積流量為1 BV/h，然后分別用1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV 的蒸餾水沖洗，后測脫色液色素量，最后將溶液與洗液合并，測合并液的多糖和蛋白量，每一個實驗均做兩遍，然后取其平均值，結果見圖5。

圖5 上樣量對樹脂脫色的影響

由圖5可知，當上樣量為30 mL(即1.5 BV)時的脫色效果較佳，此時的多糖保留率約為71%。

2.2.2.3 上樣質(zhì)量濃度對脫色效果的影響 用濕法裝柱，柱體積為20 mL，分別配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL的粗多糖液30 mL，上柱，迅速調(diào)節(jié)體積流量為1 BV/h，然后用3 BV的蒸餾水沖洗，后測脫色液色素量，最后將溶液與洗液合并，測合并液的多糖和蛋白量，每一個實驗均做兩遍，然后取其平均值，結果見圖6。

圖6 上樣質(zhì)量濃度對樹脂脫色的影響

由圖6可知，質(zhì)量濃度為2 mg/mL時脫色效果較好，但此時多糖保留率僅為33%，當上樣質(zhì)量濃度為6 mg/mL時多糖保留率較高為73%，脫色率也較高為94.21%。因此，選用6 mg/mL為適宜上樣質(zhì)量濃度。此時蛋白去除率為76.50%。

2.2.3 重復驗證實驗 按照上述最優(yōu)條件進行了3批驗證實驗，實驗結果如表1所示。由表可知在此工藝條件下實驗結果比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

表1 動態(tài)吸附驗證實驗結果

3 結論

實驗結果表明:雙氧水法、活性炭法和反膠束溶液法對多糖脫色都有不同程度的損失;樹脂法不僅脫色效果最好，而且同時具有多糖保留率高和一定脫除蛋白作用的優(yōu)點。

采用LS-206樹脂吸附脫色的最佳工藝條件為:體積流量1 BV/h，上樣量為1.5 BV，上樣質(zhì)量濃度為6 mg/mL。采用此工藝對款冬花多糖提取液脫色率可達94.19%，多糖保留率為73.02%，蛋白質(zhì)去除率為76.44%。

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