喬 湜， 石 蕊， 蔣午峻， 盧樹(shù)杰， 王 巧*， 張?zhí)m桐

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，河北石家莊 050017;2.河北省中藥注射劑工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 051430)

滋心陰口服液是由北沙參、赤芍、麥冬、三七四味中藥加工而成的一種中藥復(fù)方制劑［1］，具有滋養(yǎng)心陰、活血止痛之功效［2-3］。有關(guān)其質(zhì)量控制的報(bào)道主要集中在芍藥苷單一成分的高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定［4-5］。《中國(guó)藥典》(2010 版)也僅對(duì)滋心陰口服液中芍藥苷進(jìn)行了HPLC法含量測(cè)定，且樣品的前處理較繁瑣。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)［6-8］具有專(zhuān)屬、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，是混合物中化學(xué)成分定性和定量分析的有力工具。本研究即采用HPLC-MS法對(duì)滋心陰口服液中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷2種苷類(lèi)成分和花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯4種香豆素類(lèi)成分進(jìn)行了含量測(cè)定，以期為其質(zhì)量控制提供新方法。

1 儀器與試劑

3200Q-Trap質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)，配有三重四級(jí)桿線(xiàn)性離子阱質(zhì)量分析器和Toubo V電噴霧離子源;Agilent1200液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，配有四元梯度洗脫泵，自動(dòng)進(jìn)樣器和在線(xiàn)脫氣機(jī);Analyst 1.4.2分析軟件(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);BP211D型電子分析天平(德國(guó) Satrorius公司);LG16-B型離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)。

甲醇(色譜純，美國(guó)迪馬公司);甲酸(色譜純，美國(guó)迪馬公司);純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限責(zé)任公司)。

對(duì)照品芍藥苷(批號(hào):110736-200629)和補(bǔ)骨脂素(批號(hào):110739-200613)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;芍藥內(nèi)酯苷(深圳市美荷生物科技有限公司，含量大于98%)，花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯(上海同田生物技術(shù)有限公司，含量大于98%);滋心陰口服液(湖北福人金身藥業(yè)有限公司，批號(hào):20090401041，20090804141，20091003118，20100102111)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18column(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇(A)和0.1‰甲酸-水(B)，梯度洗脫，洗脫程序如下:0～4 min，40% ～95%A;4 ～7 min，保持 95%A不變;7～7.5 min，95% ～40%A。柱溫:室溫，流速:0.8 mL/min，進(jìn)樣量:10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子(ESI)源;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;采用正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)，0～5 min采用負(fù)離子模式，用于芍藥內(nèi)酯和芍藥苷的測(cè)定，5～7.5 min采用正離子模式，用于花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯的測(cè)定;源噴射電壓:5 500/－4 500 V;源溫度(TEM):650℃;簾氣(CUR):20 psi;霧化氣(gas 1):60 psi，加熱氣(gas 2):65 psi，均為氮?dú)狻?種被測(cè)成分監(jiān)測(cè)離子對(duì)、解簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)見(jiàn)表1，二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

表1 滋心陰口服液中6種化學(xué)成分的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子與主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The retention time(tR)，MS/MS fragment ions and main mass parameters of the 6 analytes in Zixinyin Oral Liquid

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 精密量取滋心陰口服液2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇-水(40∶60)至刻度，搖勻。離心(轉(zhuǎn)速10 000 r/min)10 min，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取對(duì)照品芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯適量，分別置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，得貯備液。精密量取上述各貯備液適量于10 mL量瓶中，加甲醇-水(40∶60)稀釋至刻度，搖勻，即得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯的混合對(duì)照品溶液，濃度分別為 64.410，993.680，1.800，0.570，0.625 μg/mL 和 0.366 μg/mL。

圖1 對(duì)照品二級(jí)離子掃描質(zhì)譜圖A.芍藥內(nèi)酯苷 B.芍藥苷 C.花椒毒素 D.補(bǔ)骨脂素 E.異茴芹內(nèi)酯 F.佛手柑內(nèi)酯Fig.1 Product ion scan spectra of the standardsA.albiflorin B.paeoniflorin C.xanthotoxin D.psoralen E.isopimpinellin F.bergapten

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷，花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯分別來(lái)源于赤芍和北沙參藥材，按照處方比例及工藝，分別制備缺少赤芍和北沙參藥材的陰性對(duì)照樣品，并按2.2.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備各陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取各陰性對(duì)照溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，由HPLC色譜圖(見(jiàn)圖2)可知，兩種陰性對(duì)照溶液中均未檢測(cè)到干擾成分，表明方法專(zhuān)屬性良好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢測(cè)限和定量限 精密量取混合對(duì)照品溶液2.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇-水(40∶60)稀釋至刻度，濃度分別為:芍藥內(nèi)酯苷16.102 μg/mL，芍藥苷 248.420 μg/mL，花椒毒素 0.450 μg/mL，補(bǔ)骨脂素0.143 μg/mL，異茴芹內(nèi)酯 0.156 μg/mL和佛手柑內(nèi)酯0.092 μg/mL，依次逐級(jí)稀釋2倍，定容，制得6個(gè)濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并進(jìn)行一元線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程(見(jiàn)表2)。將混合對(duì)照品溶液逐步稀釋?zhuān)謩e以信噪比S/N=10和S/N=3時(shí)各對(duì)照品的量作為定量限和檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 滋心陰口服液中6種化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、檢測(cè)限和定量限Tab.2 Linear regression data，LODs and LOQs of the six analytes in Zixinyin Oral Liquid

2.5 儀器重復(fù)性試驗(yàn) 取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為:芍藥內(nèi)酯苷 4.026 μg/mL，芍藥苷 62.105 μg/mL，花椒毒素 0.113 μg/mL，補(bǔ)骨脂素 0.036 μg/mL，異茴芹內(nèi)酯0.039 μg/mL和佛手柑內(nèi)酯0.023 μg/mL，按2.1項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄6種成分的峰面積，得RSD值分別為0.21%、0.33%、0.49%、0.22%、0.34%和0.57%。

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批滋心陰口服液，制備供試品溶液6份，分別測(cè)定，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯6次測(cè)定結(jié)果的RSD值分別為1.4%、1.1%、1.8%、1.1%、1.3%和3.0%。

2.7 回收率試驗(yàn) 精密量取同一批滋心陰口服液1 mL共6份，分別置10 mL量瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇-水(40∶60)稀釋至刻度。按2.2.1項(xiàng)下操作，制備供試品溶液，測(cè)定6種化合物的峰面積，計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)Tab.3 The method recoveries for six analytes(n=6)

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別在室溫下放置 0、2、4、6、8、10、12 h 時(shí)進(jìn)行測(cè)定，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為1.2%、1.3%、0.60%、0.50%、1.1%和0.70%，表明供試品室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品測(cè)定 取4批滋心陰口服液，制備供試品溶液，進(jìn)行分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算6種成分的含 量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 滋心陰口服液中6種化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.4 The contents of six analytes in Zixinyin Oral Liquid samples(n=3)

3 討論

一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在負(fù)離子檢測(cè)模式下分別易產(chǎn)生加合離子峰［M+HCOO］－和準(zhǔn)分子離子峰［M －H］－，而花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素在正離子模式下易產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+。本實(shí)驗(yàn)采用正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)，既保證了檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性，又提高了工作效率。

分別考察了流動(dòng)相中加入3種不同的電解質(zhì)甲酸、乙酸以及醋酸銨對(duì)化合物響應(yīng)值的影響，發(fā)現(xiàn)加入甲酸后響應(yīng)值和峰形優(yōu)于乙酸和醋酸銨。對(duì)甲酸的比例進(jìn)一步考察，發(fā)現(xiàn)0.1‰甲酸能夠達(dá)到最佳的分離效果和穩(wěn)定的響應(yīng)值，故以甲醇和0.1‰甲酸水作為流動(dòng)相梯度洗脫，6種被分析物在7.5 min內(nèi)全部出峰，而且不受其他化合物的干擾。

滋心陰口服液中北沙參具有滋陰功效，赤芍具有活血功效。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇北沙參中的花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素以及赤芍中的芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷作為定量指標(biāo)。對(duì)北沙參的成分歐前胡素和異歐前胡素也進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，但未檢測(cè)到該兩種物質(zhì)，推測(cè)可能與滋心陰口服液的制備工藝有關(guān)。

目前，HPLC-UV法［9-11］常用于中藥及其制劑的質(zhì)量控制，然而對(duì)于這一復(fù)雜體系的分析，采用HPLC-MS法則表現(xiàn)出更多的優(yōu)越性。HPLC-MS法不要求被測(cè)成分完全分離，且具有更高的專(zhuān)屬性和靈敏度。本實(shí)驗(yàn)中花椒毒素和補(bǔ)骨脂素的保留時(shí)間相同，但因MRM掃描模式監(jiān)測(cè)的離子對(duì)不同(分別為217.1/202.1和187.2/131.1)，即可使兩種成分在同時(shí)洗脫的情況下分別準(zhǔn)確定量，避免了繁瑣的色譜分離條件考察過(guò)程，且分析時(shí)間也明顯縮短，本實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品的分析時(shí)間僅為7.5 min。

本研究采用HPLC-MS方法對(duì)滋心陰口服液中6種成分進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，方法快速、準(zhǔn)確，為滋心陰口服液的質(zhì)量控制提供了新手段，同時(shí)HPLC-MS的應(yīng)用，也為專(zhuān)屬、有效的中藥現(xiàn)代質(zhì)量控制體系的建立提供了一個(gè)可行的方向。

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