馬曉麗， 常軍民， 李毓斌， 孟 磊

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心;2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830054)

天山花楸Sorbus tianschanicaRuper.為薔薇科Rosacea花楸屬Sorbus植物天山花楸Sorbus tianschanicaRuper.的干燥嫩枝葉，主產(chǎn)于新疆的天山山脈，是維吾爾民間習(xí)用藥材之一，藥理學(xué)研究證明其具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、強(qiáng)心和保護(hù)心肌缺血等作用［1－2］。黃酮類化合物在天山花楸中分布較廣，是其主要活性成分之一［3］。

天山花楸中黃酮類成分的檢測(cè)方法大多采用HPLC法［4－9］而且多為單一成分檢測(cè)。高效毛細(xì)管電泳法［10－12］是近年發(fā)展起來(lái)的一種具有高效、靈敏和低耗的分析方法，已廣泛應(yīng)用于中草藥的活性成分測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)首次采用高效毛細(xì)管電泳法研究天山花楸干燥枝葉中的3種黃酮類成分(蘆丁、金絲桃苷和槲皮素)，旨在建立一種簡(jiǎn)單、快速能同時(shí)分離測(cè)定天山花楸中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量的方法，以期為天山花楸資源的開(kāi)發(fā)和利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Beckman P/ACETM MDQ型高效毛細(xì)管電泳儀(Beckman公司，美國(guó))，二極管陣列檢測(cè)器，石英毛細(xì)管柱(58.5 cm × 75 μm，有效長(zhǎng)度 48.5 cm，河北永年);FE20－pH 計(jì)(METTLER TOLEDO公司);XS205電子天平(METTLER TOLEDO)。

蘆丁、金絲桃苷和槲皮素對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢 定 所 (批 號(hào) 分 別 為:100080－200306，111521－200303，100081－200406)。天山花楸采自新疆呼圖壁縣林場(chǎng)，并經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室帕麗達(dá).阿不力孜教授鑒定。試劑均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 電泳條件

石英毛細(xì)管柱(58.5 cm×75 μm，有效長(zhǎng)度48.5 cm);運(yùn)行緩沖液:10 mmol/L的Na2B4O7－20 mmol/L的NaH2PO4(pH8.30);分離電壓20 kV(+)→(－);電泳時(shí)間20 min;電泳溫度25℃;壓力進(jìn)樣0.5psi×20s;柱上檢測(cè)UV 254 nm(二極管陣列檢測(cè)器)。清洗程序:第一次進(jìn)樣前分別以甲醇、雙蒸水、0.1mol/L鹽酸、雙蒸水、0.1mol/L NaOH、雙蒸水、緩沖溶液沖洗毛細(xì)管20psi×3min;每次進(jìn)樣間用0.1 mol/L NaOH 沖洗20psi×5 min，雙蒸水沖洗20psi×5 min，最后用緩沖溶液沖洗20psi×5 min。每變換一次電泳緩沖液，均用緩沖液平衡至電流平穩(wěn)(10 min)后才能進(jìn)樣測(cè)量。樣品及緩沖液均在4℃儲(chǔ)存，在使用前用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，且臨用前超聲脫氣處理。

2.2 對(duì)照品貯備液的制備

分別精確稱取蘆丁、金絲桃苷及槲皮素對(duì)照品各10.0 mg，置于10 mL量瓶?jī)?nèi)，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為1 mg/mL的對(duì)照品貯備液;放置－4℃冰箱中保存，在使用前按要求稀釋。

2.3 供試品的制備

樣品研磨均勻，過(guò)20目篩，精密稱取5.0 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加甲醇50 ml超聲提取(30 min×3)，合并提取液，4 000 r/min離心15 min，取上清液將甲醇揮盡，用水溶解，再用乙醚萃取，將水溶液濃縮至10 mL，搖勻，制成供試品溶液，放置－4℃冰箱中保存。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取0.0625，0.125，0.185，0.25，0.375 mL 蘆丁對(duì)照品貯備液置于5個(gè)10 mL量瓶中，并依次加入金絲桃苷對(duì)照品貯備液 0.125、0.25、0.375、0.5、0.67 mL 及槲皮素對(duì)照品貯備液 0.025、0.05、0.075、0.1、0.13 mL，后用甲醇稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品混合液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明混合標(biāo)準(zhǔn)品在線性范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1，電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁、金絲桃苷、槲皮素混合標(biāo)準(zhǔn)品的CZE圖

表1 蘆丁、金絲桃苷、槲皮素線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 進(jìn)樣精密度考察

考察所建立方法在相同操作條件下短時(shí)間內(nèi)的精密度:取對(duì)照品混合液(蘆丁25 μg/mL，金絲桃苷50 μg/mL，槲皮素10 μg/mL)，連續(xù)5次重復(fù)進(jìn)樣分析每次進(jìn)樣20 s，測(cè)得蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對(duì)照品峰面積的RSD分別為0.9%，1.2%，2.7%。遷移時(shí)間的 RSD分別為0.14%、0.13%、0.14%。結(jié)果表明，此分析方法精密度好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品混合液(蘆丁25 μg/mL，金絲桃苷50 μg/mL，槲皮素10 μg/mL)，每隔2 h連續(xù)12 h考察樣品的日內(nèi)穩(wěn)定性，每次進(jìn)樣20s。測(cè)得蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對(duì)照品峰面積的RSD分別為1.7%，1.8%，2.7%。遷移時(shí)間的RSD分別為0.80%、1.04%、1.36%。結(jié)果表明蘆丁、金絲桃苷及槲皮素對(duì)照品溶液的日內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.7 方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次天山花楸樣品各6份，按2.3項(xiàng)下操作制備樣品溶液，經(jīng)測(cè)定樣品中蘆丁、金絲桃苷及槲皮素峰面積的RSD%分別為1.1%，0.4%，2.6%，遷移時(shí)間的RSD%分別為0.14%，0.12%，0.10%。結(jié)果表明，該方法對(duì)蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量測(cè)定具有較好的重現(xiàn)性。

2.8 加樣回收率

取已知含量的樣品，定量加入混合對(duì)照品，以2.3項(xiàng)進(jìn)行處理，重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得吸收峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測(cè)定

取不同時(shí)間采集的天山花楸樣品，每種樣品按照供試品制備方法值得天山花楸供試品液3份，使用前精密吸取貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣分析。采用外標(biāo)法測(cè)定樣品，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3，電泳圖見(jiàn)圖2。

表3供試品測(cè)定結(jié)果

3 討論

電泳緩沖液對(duì)分離的影響:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，使用Na2HPO4－NaH2PO4時(shí)，3種黃酮類成分分離不好，峰拖尾嚴(yán)重;在Na2B4O7－NaH2PO4時(shí)，由于黃酮類化合物在堿性條件下可與硼酸根離子絡(luò)合從而增加溶解度減少吸附引起的拖尾，3種化合物達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱。緩沖液的酸度和濃度對(duì)分離具有明顯的影響。3種黃酮類成分的分離度隨硼砂緩沖液pH值增加而提高，但當(dāng)pH值過(guò)高時(shí)，電流增加過(guò)高，基線噪音增加，各峰的保留時(shí)間都增加，且出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，在硼砂濃度為10 mmol/L，緩沖液pH8.3時(shí)，得到較理想的CZE分離效果，3種成分的分離度R＞1.5。本實(shí)驗(yàn)還考察25，20，15，10，5 kV等不同CZE電壓條件對(duì)樣品分離的影響。結(jié)果表明，當(dāng)分離電壓低于15 kV時(shí)，電流減小，譜峰展寬;電壓為20 kV，電流穩(wěn)定，分離效果良好;同時(shí)柱溫考察結(jié)果表明，25℃柱溫較為理想，大于或小于此溫度，各組分對(duì)照品的CZE峰不能達(dá)到完全基線分離。

圖2

通過(guò)CZE分離條件的優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)選擇緩沖體系為10 mmol/L 的 Na2B4O7－20 mmol/L 的 NaH2PO4(pH8.30)，電壓20 kV，柱溫25℃的CZE分離體系，能得到較理想的分離效果。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化的電泳條件下對(duì)天山花楸中的黃酮類成分(蘆丁、金絲桃苷及槲皮素)進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果表明，不同采集年份的天山花楸中黃酮類成分的含量存在一定的差異，2007年采集的天山花楸中金絲桃苷含量最高。采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定天山花楸中黃酮類成分具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、低耗等特點(diǎn)，適合于天山花楸中黃酮類組分的含量測(cè)定。

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