張永太， 馮年平， 趙繼會， 修彥鳳， 陶建生

(上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203)

芪丹冠心舒微丸為我校與企業(yè)合作開發(fā)的六類中藥新藥，原方中黃芪、丹參、三七三味藥材經(jīng)醫(yī)用酒精提取，所得提取物得膏率較高，有必要對其進(jìn)行進(jìn)一步的純化研究。目前，大孔吸附樹脂已廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥工業(yè)，在中藥有效物質(zhì)的分離純化中也有較多應(yīng)用。本研究即采用大孔樹脂，對提取物中有效組分進(jìn)行分離純化工藝研究，進(jìn)一步減小得膏率，富集有效成分，為后續(xù)制劑研究擴(kuò)展空間［1－3］。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(美國Agilent公司，1100型);紫外可見光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司，UV754N型);電子天平(德國 SARTORIUS，BP211D型)。

實(shí)驗(yàn)所用色譜純化學(xué)試劑與分析純化學(xué)試劑均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，95%醫(yī)用酒精購自上海中醫(yī)藥大學(xué)設(shè)備處，大孔樹脂購自上海摩速科學(xué)器材有限公司。

化學(xué)對照品購自上海市藥品檢驗(yàn)所，均為中國藥品生物制品檢定所提供，分別為:丹酚酸B(批號:20070212);黃芪甲苷(批號:20070417);三七皂苷R1(批號:20070509);人參皂苷 Rb1(批號:20070417);人參皂苷Rg1(批號:20070417)。

實(shí)驗(yàn)用藥材，黃芪(上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司，批號:20061019)、丹參(上?？禈蛩帢I(yè)有限公司，批號:20071226)、三七 (上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司，批號:20070403)，經(jīng)我校生藥學(xué)教研室專家鑒定，均為2010版《中國藥典》收載品種［4］。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 指標(biāo)性成分檢測方法

2.1.1 紫外—可見分光光度法測定總皂苷的含量［5－6］

因黃芪為本復(fù)方中君藥，用量大，故考慮以黃芪中所含的黃芪甲苷作為指標(biāo)性成分，考察最大吸收波長。取精制的提取物總皂苷，配成濃度為0.5 mg/mL的溶液。精密吸取0.2 mL，加入香草醛溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，于60℃水浴中放置15 min后，放入冰水浴中冷卻2 min，然后加冰醋酸5 mL，進(jìn)行全波長掃描，其吸收在530～550 nm處達(dá)到最大。文獻(xiàn)查閱得知黃芪甲苷、三七皂苷類成分的最大吸收波長也在此范圍，綜合以上因素，決定以530 nm作為本研究測定總皂苷的吸收波長。

取黃芪甲苷對照品10mg，精密稱定(10.08 mg)，置10 mL量瓶中，加無水乙醇使溶解并定容。分別精密移取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL，精密加入香草醛溶液 0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，于60℃水浴中放置15 min后，放入冰水浴中冷卻2 min，然后加冰醋酸5 mL。以蒸餾水作為黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，同法制備空白對照液，以黃芪甲苷含量對吸光度做直線回歸，得回歸曲線方程為Y=0.819 1X－0.044 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999，即在黃芪甲苷量為0.075～0.76 mg范圍內(nèi)，黃芪甲苷量與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 高效液相色譜法測定丹酚酸B的含量

采用C18ODS液相色譜柱，以甲醇－乙腈－甲酸－水(30∶10∶1∶59，v/v/v/v)為流動相，流速(1 mL/min)，檢測波長為286 nm，柱溫30℃。

取丹酚酸對照品，精密稱定，以甲醇溶解并定容，制備成0.3(mg/mL)濃度溶液。分別精密移取0.25、0.50、1.00、1.50、2.50、3.75 mL，分別置 5 mL量瓶中，甲醇定容。以濃度對峰面積回歸，直線方程為Y=10－4X－0.003 9，相關(guān)系數(shù)R=0.999，表明在濃度為0.015～0.300 mg/mL濃度范圍內(nèi)，樣品濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2 樹脂型號考察 分別取 HPD100、HPD300、D101、D201、AB－8 樹脂［7－11］各 20 g，預(yù)處理后，每種型號樹脂平分成2份，即每份10 g，各加入20 mL藥液，于振動床(20℃，80 Hz)中振搖2 h，置冰箱中4℃放置12 h，取出裝柱，擠干藥液，收集藥液，用蒸餾水洗脫4次，每次50 mL。分別檢測原藥液、殘留液和蒸餾水洗脫液中總皂苷、丹酚酸B的含量，計(jì)算比上柱量與比吸附量，結(jié)果見表1。

表1 樹脂型號考察

綜合比較各樹脂的比上柱量和比吸附量，可知除D201型樹脂外，其余4種樹脂的比上柱量與比吸附量均較高，4種樹脂的比上柱量與比吸附量差異較小。雖HPD100型大孔樹脂的比上柱量與比吸附量均為最高，但考慮目前醫(yī)藥與食品工業(yè)中對AB－8和D101兩種型號的樹脂應(yīng)用最普遍，決定選用D101型大孔樹脂。

2.3 樹脂上樣方式考察［12］以比上柱量、比吸附量為考察指標(biāo)，對動態(tài)上樣與靜態(tài)吸附兩種上樣方法進(jìn)行比較。計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 樹脂上樣方式考察

由以上數(shù)據(jù)分析可知，動態(tài)上樣總皂苷的比上柱量與比吸附量均高于靜態(tài)上樣，丹酚酸B的比上柱量高于靜態(tài)上樣，比吸附量二者相當(dāng)。綜合以上考察結(jié)果，可以得出動態(tài)上樣為最佳上樣方式。

2.4 樹脂上樣工藝優(yōu)化 以比上柱量、比吸附量為考察指標(biāo)，對上樣樹脂柱的徑高比、上樣濃度、上樣次數(shù)進(jìn)行正交考察，以確定最佳上樣工藝。稱取D101大孔樹脂各10 g，照前法預(yù)處理。按L9(3)4表，分別用0.5、0.25、0.125 g生藥/mL的藥液上樣，用蒸餾水洗脫4次，每次50 mL。見表3。

表3 因素水平

分別計(jì)算各次實(shí)驗(yàn)中總皂苷與丹酚酸B的比上柱量與比吸附量，進(jìn)行分析。結(jié)果見表4與表5。

表4 樹脂上樣工藝正交優(yōu)化—總皂苷、丹酚酸B比上柱量與比吸附量綜合評分計(jì)算結(jié)果

由方差分析可得出，因素A對實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有極顯著性影響，而因素B和C對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響均不顯著。綜合正交分析結(jié)果，若以總皂苷與丹酚酸B為考察指標(biāo)，則最佳上樣工藝為A3B2C2，即上樣液濃度為0.125(g/mL)，柱徑高比為3.64(mm/cm)，上樣次數(shù)為8次。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，優(yōu)選出的工藝可靠。2.5 洗脫工藝優(yōu)化 采用L9(3)4正交試驗(yàn)，選擇乙醇濃度、乙醇用量與洗脫流速為考察因素，以洗脫百分率與洗脫純度為考察指標(biāo)，優(yōu)化洗脫工藝［13－14］。見表 6 與表 7。

表5樹脂上樣工藝正交優(yōu)化—總皂苷與丹酚酸B方差分析

表6 因素水平

分別計(jì)算各次實(shí)驗(yàn)中總皂苷與丹酚酸B的洗脫百分率與洗脫純度，分別進(jìn)行直觀分析。結(jié)果見表7。

由直觀分析可得出，以總皂苷為指標(biāo)性成分所得最佳洗脫工藝為:以60%濃度乙醇16倍量(倍樹脂重，w/w)進(jìn)行洗脫，流速為0.2倍量(倍樹脂重，w/w)/min;以丹酚酸B為指標(biāo)性成分所得最佳洗脫工藝為:以80%濃度乙醇16倍量(倍樹脂重，w/w)進(jìn)行洗脫，流速為0.2倍量(倍樹脂重，w/w)/min。以丹酚酸B和總皂苷作為指標(biāo)性成分，優(yōu)化出的最佳洗脫工藝均為乙醇16倍量(倍樹脂重，w/w)進(jìn)行洗脫，流速為0.2倍量(倍樹脂重，w/w)/min。因60%乙醇與80%乙醇洗脫丹酚酸B成分的效果相差不大，從節(jié)省溶劑成本的角度，宜選用60%濃度的乙醇作為洗脫溶劑。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，優(yōu)選出的工藝可靠。

表7 洗脫條件正交優(yōu)化—總皂苷與丹酚酸B洗脫百分率與洗脫純度綜合評分計(jì)算結(jié)果

中試研究結(jié)果顯示，經(jīng)過大孔樹脂純化后，所得干浸膏量由原來的60%(干浸膏/藥材，w/w)下降到20%，各指標(biāo)性成分的轉(zhuǎn)移率均在80%以上，達(dá)到了預(yù)期目的。

3 小結(jié)

3.1 對上樣方式的考察結(jié)果顯示，動態(tài)吸附效果優(yōu)于靜態(tài)吸附。目前生產(chǎn)中多采用靜態(tài)上樣作為上樣方法［15］，主要因?yàn)槠洳僮鞅容^方便。但經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)中靜態(tài)上樣與動態(tài)上樣相比，比上柱量與比吸附量均明顯小于后者，兼考慮到動態(tài)上樣雖需在洗脫柱中完成，但其耗時短，無須振蕩，且上樣后可直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理，因此最終確定動態(tài)上樣方式。

3.2 在對上樣方式的考察中，確定在2 h內(nèi)完成，主要是考慮工作效率和體現(xiàn)動態(tài)上樣之于靜態(tài)上樣在效率方面的優(yōu)越性。結(jié)果顯示，在2 h內(nèi)動態(tài)上樣8次則可保證達(dá)到最佳吸附效果。

3.3 洗脫工藝的考察中，首先對洗脫溶媒進(jìn)行單因素考察，制備了洗脫曲線，為采用正交試驗(yàn)考察洗脫工藝中選取因素水平提供參考。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，總皂苷與丹酚酸B在乙醇濃度為60%時均可達(dá)到較好的解吸效果，且所得固形物中以上兩種成分純度較高。

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