趙永新， 宋向鳳， 郭繼強(qiáng)， 王 輝

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

蝎毒在中醫(yī)治療上，鎮(zhèn)痛、抗驚厥、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等方面的實(shí)踐已取得了很好的效果［1］。其中起主要藥理作用的蝎毒組分Ⅲ是從河南馬氏鉗蝎毒中分離出的一種成分，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞系有顯著的細(xì)胞殺傷和細(xì)胞毒性作用［2－3］。研究資料表明蝎素具備細(xì)胞毒性作用的同時(shí)，還有重要的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的作用，可顯著增強(qiáng)小鼠的免疫功能，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和 TNF－a的分泌，使用藥量顯著減少并可增強(qiáng)其它抗腫瘤藥物的效應(yīng)。但關(guān)于蝎素對(duì)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)影響研究較少，SCVⅢ對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制尚不清楚。本研究以Jurkat細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察 SVCⅢ對(duì)Jurkat細(xì)胞IKK1、IкBa mRNA表達(dá)的影響，以及對(duì) Jurkat細(xì)胞中 NF－кB活化的影響，并探討SVCⅢ參與細(xì)胞免疫調(diào)控的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 T淋巴細(xì)胞系Jurkat購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，TfxTM－50質(zhì)粒由美國(guó)NIH欒好江博士惠贈(zèng)。轉(zhuǎn)染試劑TfxTM－50 Reagent、逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV購(gòu)自Promega公司產(chǎn)品，總RNA抽提試劑盒Rneasy Mini kit購(gòu)自QIAGEN公司 ，SVC－Ⅲ由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分析測(cè)試研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Jurkat細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，聚集成團(tuán)狀為生長(zhǎng)良好，每2～3 d換1次培養(yǎng)液。

1.2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與熒光素酶相對(duì)活性測(cè)定 按照TfxTM－50 Reagent(Promega)產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作。將質(zhì)粒 NF－кB－Luc 和內(nèi)對(duì)照 β－Gal轉(zhuǎn)染 Jurkat細(xì)胞，轉(zhuǎn)染5 h后加入終濃度為0、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL、10 ng/mL和 100 ng/mL的 SVC－Ⅲ。48 h后將細(xì)胞收集于1.5 ml EP管，用0.01 mol/L pH7.2的PBS洗2次，加入200 μL裂解液，室溫放置15 min，渦旋振蕩混勻，12 000 r/min 4℃ 離心10 min，收取20 μL上清細(xì)胞裂解液放置于測(cè)定管中，加入100 μL熒光素酶反應(yīng)底物，在熒光分析儀上測(cè)定熒光強(qiáng)度，檢測(cè)時(shí)間為20 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 RT－PCR擴(kuò)增IKK1、IкBa 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Jurkat細(xì)胞離心收集，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，分裝于24孔培養(yǎng)板中，1 mL/孔，加入到終濃度為 0、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL、10 ng/mL 和 100 ng/mL的SVC－Ⅲ。48 h后用QIAGEN總RNA抽提試劑盒提取Jurkat細(xì)胞總RNA，按說(shuō)明進(jìn)行操作。擴(kuò)增所用基因引物:IKK1:上游:5′－GCAGAGAGGAGGACCTGTTG－3′，下游:5′－ACTGCTTCAGCCCACACTTT－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為 438 bp;IкBa:上游:5′－AACCTGCAGCAGACTCCACT－3′，下 游:5′－ACACCAGGTCAGGATTTTGC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為 376bp;內(nèi)參GAPDH:上游:5′－TTAGCACCCCTGGCCAAGG－3′，下游:5′－CTTACTCCTTGGAGGCCATG－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為550bp。PCR反應(yīng)條件為:95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30，循環(huán)36次，最后在72℃延伸5 min。同管在擴(kuò)增到 24、28、32、36 循環(huán)時(shí)，分別取10 μL備用。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，用凝膠成像系統(tǒng)掃描。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 NF－κB熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果SVCⅢ濃度的逐漸增加(0.1 ng/mL、1.0 ng/mL)對(duì)Jurkat細(xì)胞 NF－κB的作用逐漸增強(qiáng)。濃度增加到1.0 ng/mL時(shí)，SVCⅢ對(duì)NF－κB的作用最強(qiáng)。隨著SVCⅢ濃度的增加到一定濃度(10 ng/mL、100 ng/mL)，SVCⅢ對(duì) Jurkat細(xì)胞 NF－κB 的作用減弱。

2.2 Jurkat細(xì)胞株中IKK1和IкBa mRNA的檢測(cè)SVC－Ⅲ濃度的逐漸增加(0.1 ng/mL、1.0 ng/mL)對(duì)Jurkat細(xì)胞的IKK1和IкBa的表達(dá)作用逐漸增強(qiáng)。濃度增加到1.0 ng/mL時(shí)，SVCⅢ對(duì)IKK1和IкBa的mRNA的表達(dá)作用最強(qiáng)。隨著SVCⅢ濃度的增加到一定濃度(10 ng/mL、100 ng/mL)，SVCⅢ對(duì)Jurkat細(xì)胞IKK1和IкBa的表達(dá)作用減弱。各組中隨著循環(huán)的增加 IKK1、IкBa的mRNA表達(dá)是逐漸增強(qiáng)的。無(wú)SVCⅢ刺激，IкBa的表達(dá)強(qiáng)于IKK1;SVCⅢ(0.1、1.0、10、100 ng/mL)刺激組，IKK1 的表達(dá)強(qiáng)于 IкBa。見圖 1 ～2。

圖1 NF-κB熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 NF-κB fluorescent element enzyme gene transfection experimental results

圖2 不同濃度SVCⅢ刺激Jurkat細(xì)胞 IKK1、IкBa和GAPDH在24、28、32和36循環(huán)mRNA的表達(dá)Fig.2 The expression of different concentration SVCⅢstimulate IKK1，IкBa and GAPDH of 24，28，32 and 36 mRNA cycle in Jurkat cell

3 討論

近年來(lái)，蝎素作為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的研究已引起廣泛重視，我們以前的研究顯示SVCⅢ能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤壞死因子的分泌［4］，能以劑量依賴的方式調(diào)節(jié)Jurkat細(xì)胞中信號(hào)分子ZAP－70和LAT的表達(dá)［5］。蝎毒多肽提取物可以改善荷瘤機(jī)體細(xì)胞免疫功能的抑制狀態(tài)，增強(qiáng)其識(shí)別、殺傷突變細(xì)胞的能力，發(fā)揮抗腫瘤作用，腫瘤抑制率可達(dá) 55.21%［3］。

關(guān)于蝎素對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響研究較少，SVC－Ⅲ對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的機(jī)制尚不完全清楚。Jurkat E6－1細(xì)胞是人類T淋巴腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞株，在功能上與人類 T淋巴細(xì)胞有很多共同的特點(diǎn)，T淋巴瘤的激活與凋亡有很多種因素，在免疫調(diào)節(jié)中具有十分重要的作用機(jī)制，已廣泛用于實(shí)驗(yàn)室研究。本研究以Jurkat E6－1細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察不同濃度的SVC－Ⅲ對(duì)Jurkat細(xì)胞NF－кB信號(hào)通路的影響，以探討SVC－Ⅲ抗腫瘤的作用，為抗腫瘤治療尋求更加有效的方法。并探討SVC－Ⅲ參與細(xì)胞免疫調(diào)控的可能機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)低劑量 SVC－Ⅲ(0.1 ng/mL、1.0 ng/mL)對(duì)Jurkat細(xì)胞 NF－кB活性及調(diào)空蛋白 IкBa及相關(guān)激酶IKK1mRNA的表達(dá)有一定促進(jìn)作用，特別是在濃度為1.0 ng/mL時(shí)作用最強(qiáng)(P＜0.01)，而隨著濃度增高作用開始逐漸減弱。NF－кB是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控免疫細(xì)胞的激活、淋巴細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞凋亡、腫瘤形成、病毒復(fù)制、炎癥反應(yīng)及多種自身免疫性疾病方面發(fā)揮重要作用［6－8］。正常情況下NF－κB與NF－κB的內(nèi)源性抑制因子主要是IκB抑制蛋白結(jié)合，以失活的形式存在胞漿中，當(dāng)細(xì)胞接受刺激，IκB裂解，暴露出 NF－κB亞基上核定位序列和具有基因轉(zhuǎn)錄活性的反式激活域，NF－κB從胞漿移位入胞核，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。IкBa 是細(xì)胞內(nèi) NF－κB 的主要抑制因子，細(xì)胞內(nèi) IкBa的水平、IкBa受信號(hào)刺激后能否正常磷酸化進(jìn)而降解對(duì) NF－κB 活化起關(guān)鍵作用［9－10］，而 IкBa 的磷酸化受IκB激酶(IKK)的調(diào)節(jié)。IKK1可使 NF－кB抑制蛋白IкB被磷酸化，通過(guò)泛素降解途徑使 IкB由NF－кB 二聚體上解聚，從而激活了 NF－кB，進(jìn)而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。一些體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究表明，NF－кB在乳腺癌中異常激活，抑制乳腺癌細(xì)胞NF－кB的活性可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)［11］。從本實(shí)驗(yàn)中可以看出高劑量的可以通過(guò)IKK1 抑制 IкBa 的磷酸化，IкBa 不能從 NF－кB 二聚體上解聚，NF－κB未能被激活，不能調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。SVC－Ⅲ通過(guò)抑制NF－кB活性的作用，可以阻斷NF－κB信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖，使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。

以上研究結(jié)果表明高濃度SVC－Ⅲ可抑制Jurkat細(xì)胞IкBa蛋白的磷酸化，抑制NF－κB途徑的激活，從而阻斷NF－κB 信號(hào)通路IKK1、IкBa表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、抑制腫瘤細(xì)胞增殖?？梢妼?duì)NF－κB的深入研究為抗腫瘤治療提供了新的、更為有效的作用靶點(diǎn)，為臨床癌癥病人的治療提供了一種有效的治療手段。

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