劉明龍， 曾永祥， 盧守燕， 李建華， 劉天喜， 趙建雄

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院腎病科，甘肅蘭州 730000;2.甘肅省醫(yī)療器械檢測中心，甘肅蘭州 730000)

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 復(fù)腎顆粒(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科);優(yōu)級(jí)胎牛血清(杭州四季青)，F(xiàn)12/DMEM

(1∶1)培養(yǎng)液、Hepes、胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶(美國Gibco)，人Ⅳ型膠原(ColⅣ)ELISA試劑盒(美國ADL)，轉(zhuǎn)化生長因子－β1(TGF－β1，美國 Sigma)，Trizol(美國Invitrogen)，兔抗大鼠TAK1多克隆抗體、鼠抗β－actin單克隆抗體(美國Cell Signaling)，HRP標(biāo)記羊抗兔、抗鼠IgG二抗(美國Santa Cruz)，PVDF Western轉(zhuǎn)印膜、ECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Millipore)，RIPA裂解液、脫脂奶粉(北京普利萊)，PCR引物(上海生工)。

1.2 含藥血清的制備 正?！嵝訵istar大鼠給予復(fù)腎顆粒大、中、小劑量組分別是9 g/(kg·d)、4.5

g/(kg·d)、2.25 g/(kg·d)灌胃 7 d，制備含藥血清，分別離體實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組給予等體積生理鹽水，于末次給藥后1 h，心臟穿刺取血，3 000 r/min離心分離血清，56℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾膜過濾除菌，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 正常人近端腎小管上皮細(xì)胞系HK－2由蘭州陸軍總醫(yī)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的F12/DMEM(F/D 1∶1)培養(yǎng)液中，37℃ 5%CO2孵育，選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以105/mL接種于培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶，至細(xì)胞亞融合以無血清F/D孵育24 h使細(xì)胞同步化，進(jìn)入靜止期，然后加入不同濃度含藥血清的10%胎牛血清F/D完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 細(xì)胞接種于96孔板，亞融合狀態(tài)時(shí)同步后，棄細(xì)胞上清，多組加入不同濃度含藥血清的培養(yǎng)液100 μL，對(duì)照組直接加入培養(yǎng)液100 μL。在各時(shí)間點(diǎn)分別加入含1 g/L MTT培養(yǎng)液100 μL孵育4 h，棄上清，加入 DMSO溶解，對(duì)照組直接加DMSO定零點(diǎn)值，充分震蕩后，在酶標(biāo)儀上用檢測波長570 nm、參考波長630 nm作比色分析，測定吸光度值(A)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 ELISA法測定Col IV含量 各組細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48 h，分別取培養(yǎng)上清液100 μL，加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，按ELISA檢測試劑盒說明書依次加入各種試劑，酶標(biāo)儀492 nm處檢測A值。

1.4.3 Western－bloting法檢測細(xì)胞TAK1蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48 h，棄上清，4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，加入300 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰浴提取總蛋白，4℃ 12 000 g離心15 min，取上清BCA法測定總蛋白濃度。各組取50 μg總蛋白以10%SDS－PAGE 電泳90 min，0.8 mA/cm2條件半干電轉(zhuǎn)移2 h至活化的PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜后加入一抗(TAK1、1∶500，β－actin、1 ∶1 000)，搖床4 ℃過夜，再次洗膜用 HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，暗室ECL化學(xué)發(fā)光準(zhǔn)確顯影，掃描圖像，對(duì)照Marker確定特異性目的條帶，以β－actin表達(dá)作為內(nèi)參照，目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶的累積光密度(IOD)比值為最終結(jié)果［5］。

1.4.4 RT－PCR法檢測細(xì)胞TAK1 mRNA的表達(dá) Trizol提取HK－2細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度法、吸光度260/280測定RNA純度及濃度。TAK1 mRNA和β－actin mRNA用于RT－PCR擴(kuò)增，兩步法Real Time PCR反應(yīng)在Rotor－Gene 3000熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Corbett Research)上進(jìn)行。利用反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptTM Buffer將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體積 20 μL:Buffer 4 μL，RT Enzyme Mix 1，Oligo dt Prime，Random 6 Primes 各 1 μL，總 RNA 13 μL，反應(yīng)條件37℃ 15 min，85℃ 5 s;PCR擴(kuò)增體系為 25 μL:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2 × )12.5 μL，F(xiàn)orward primer，Reverse primer各0.25 μL，ddH2O 10 μL，含cDNA模板的 RT反應(yīng)液2 μL，擴(kuò)增條件:預(yù)變性95℃ 10 s，變性95℃ 5 s，退火、延伸60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，利用系統(tǒng)分析軟件，以β－actin為內(nèi)參照，采用相對(duì)定量的2－△△CT法分析 PCR 結(jié)果［6］。

表1 RT-PCR引物序列及擴(kuò)增片段

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，其中兩組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HK－2細(xì)胞增殖情況 與對(duì)照組相比，TGF－β1 5 ng/mL能夠顯著誘導(dǎo)HK－2細(xì)胞增殖，并隨著時(shí)間延長而增強(qiáng)(P＜0.05，P＜0.01)，復(fù)腎顆粒干預(yù)后，

細(xì)胞增殖速度較同時(shí)間點(diǎn)TGF－β1組細(xì)胞減緩，其促細(xì)胞增殖作用受到顯著抑制，尤以干預(yù)3組為甚(P＜0.01)。見表2。

表2 不同時(shí)間MTT檢測各組HK-2細(xì)胞增殖情況(A，± s，n=6)

表2 不同時(shí)間MTT檢測各組HK-2細(xì)胞增殖情況(A，± s，n=6)

注:與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，*P＜0.01，**P＜0.05;與同時(shí)間點(diǎn) TGF－β1組比較，△P ＜0.01。

組別0.222±0.013 0.306±0.015 0.368±0.023 TGF－β1組 0.275±0.013* 0.364±0.013* 0.445±0.021*干預(yù)1組 0.244±0.010*△ 0.336±0.014*△ 0.413±0.016*△干預(yù)2組 0.243±0.007*△ 0.315±0.011△ 0.390±0.014**△干預(yù)3組 0.230±0.008△ 0.295±0.014△ 0.374±0.014 12 h 24 h 48 h對(duì)照組△

2.2 HK－2細(xì)胞培養(yǎng)上清中Col IV含量ELISA檢測 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各組細(xì)胞培養(yǎng)上清Col IV含量均有一定程度的增加，各時(shí)間點(diǎn)TGF－β1組細(xì)胞培養(yǎng)上清Col IV含量顯著高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組，尤以24、48 h為甚(P＜0.01);復(fù)腎顆粒干預(yù)后，Col IV含量顯著低于同時(shí)間點(diǎn) TGF－β1組(P＜0.05，P＜0.01)。見表3。

表3 不同時(shí)間各組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清Col IV含量的比較(A，± s，n=8)

表3 不同時(shí)間各組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清Col IV含量的比較(A，± s，n=8)

注:與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，*P＜0.01，**P＜0.05;與同時(shí)間點(diǎn) TGF－β1組比較，△P ＜0.01，△△P ＜0.05。

組別12 h 24 h 48 h對(duì)照組0.333±0.013 0.363±0.015 0.379±0.023 TGF－β1組 0.366±0.013* 0.569±0.032* 0.837±0.0372*干預(yù)1組 0.350±0.009*△△ 0.484±0.015*△ 0.557±0.025*△干預(yù)2組 0.344±0.009**△ 0.415±0.015*△ 0.465±0.027*△△ △ △干預(yù)3組 0.340±0.0150.373±0.0120.409±0.021

2.3 各組細(xì)胞TAK1蛋白的表達(dá) 與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，HK－2細(xì)胞于TGF－β1誘導(dǎo)12 h時(shí) TAK1蛋白表達(dá)開始上調(diào)，24 h和48 h時(shí)表達(dá)量進(jìn)一步增加(P＜0.01);與同時(shí)間點(diǎn)TGF－β1組相比，復(fù)腎顆粒各干預(yù)組TAK1蛋白表達(dá)均下降(P＜0.01)。見表4。2.4 各組細(xì)胞TAK1 mRNA的表達(dá) HK－2細(xì)胞于TGF－β1誘導(dǎo)12 h時(shí)TAK1 mRNA表達(dá)開始上調(diào)，且隨著時(shí)間延長，表達(dá)逐漸增加，均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01);復(fù)腎顆粒干預(yù)后，TAK1 mRNA表達(dá)顯著低于同時(shí)間點(diǎn)TGF－β1組(P＜0.01)。見表5。

表4 不同時(shí)間各組HK-2細(xì)胞TAK1蛋白的表達(dá)(TAK1/β-actin，± s，n=6)

表4 不同時(shí)間各組HK-2細(xì)胞TAK1蛋白的表達(dá)(TAK1/β-actin，± s，n=6)

注:與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，*P＜0.01;與同時(shí)間點(diǎn)TGF－β1組比較，△P＜0.01。

組別12 h 24 h 48 h 0.535±0.013 0.545±0.029 0.543±0.041 TGF－β1組 0.649±0.020* 1.338±0.130* 1.618±0.121*干預(yù)1組 0.605±0.016*△ 1.115±0.108*△ 1.357±0.094*△干預(yù)2組 0.583±0.015*△ 0.960±0.088*△ 1.057±0.135*△干預(yù)3組 0.543±0.017△ 0.832±0.070*△ 0.956±0.081對(duì)照組*△

表5 不同時(shí)間各組HK-2細(xì)胞TAK1 mRNA的表達(dá)(2-△△CT，± s，n=6)

表5 不同時(shí)間各組HK-2細(xì)胞TAK1 mRNA的表達(dá)(2-△△CT，± s，n=6)

注:與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，*P＜0.01，**P＜0.05;與同時(shí)間點(diǎn) TGF－β1組比較，△P ＜0.01。

組別1.000±0.000 0.987±0.032 1.009±0.079 TGF－β1組 1.272±0.041* 1.837±0.118* 2.404±0.186*干預(yù)1組 1.140±0.018*△ 1.458±0.144*△ 1.741±0.139*△干預(yù)2組 1.052±0.084△ 1.344±0.115*△ 1.451±0.129*△干預(yù)3組 0.851±0.074*△ 1.145±0.071**△ 1.204±0.090 12 h 24 h 48 h對(duì)照組**△

3 討論

在各種慢性腎臟疾病中，腎小管上皮細(xì)胞不僅是疾病進(jìn)展中的受損者，也是間質(zhì)炎癥、纖維化過程中的積極參與者，有研究表明，腎小管上皮細(xì)胞可通過表型轉(zhuǎn)換生成肌成纖維細(xì)胞，也可過度增殖合成細(xì)胞外基質(zhì)如Col IV，參與間質(zhì)纖維化的形成［7］。近年研究表明，TGF－β1作為腎小管上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)因子之一［8－9］。TAK1 屬于絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)家族成員，是由TGF－β1參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)而得名的，研究還表明，TAK1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和纖維化疾病等病理過程及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)與細(xì)胞分化等過程［10－11］。

復(fù)腎顆粒是趙健雄教授研制的防治腎纖維化的驗(yàn)方，主要由生黃芪、丹參、川芎、大黃、鱉甲等藥物組成。我們推測復(fù)腎顆?？赡芡ㄟ^改善慢性腎病的腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化，而治療慢性腎病。

本實(shí)驗(yàn)在體外用TGF－β1誘導(dǎo)HK－2細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比，TGF－β1組細(xì)胞增殖速度明顯加快，細(xì)胞外培養(yǎng)上清Col IV含量明顯增加，增殖過程中TAK1蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)，經(jīng)不同劑量復(fù)腎顆粒血清藥物干預(yù)后，細(xì)胞增殖速度和細(xì)胞外培養(yǎng)上清中Col IV含量均下降，TAK1表達(dá)下調(diào)，這表明復(fù)腎顆粒抑制了TGF－β1的誘導(dǎo)作用，從而使TAK1生成減少，進(jìn)一步反映復(fù)腎顆?？赡苡绊慣AK1這一重要的信號(hào)通路，從蛋白或基因水平上減少TAK1的生成而發(fā)揮抗纖維化作用。

［1］王 寅，童俊容，羅正茂，等.尿激酶對(duì)環(huán)孢素A慢性腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化及轉(zhuǎn)化生長因子－β1的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(12):2449－2452.

［2］白壽軍，張亞敏，李彩霞，等.曲尼司特對(duì)TGF－β1刺激的人腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)結(jié)締組織生長因子的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38(4):477－480.

［3］宋錦葉，李 深，孟立強(qiáng)，等.黃芪當(dāng)歸合劑對(duì)5/6腎切除大鼠腎組織損傷的治療作用［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，41(2):196－202.

［4］唐錦輝，占成業(yè)，周建華，等.影響丹參酮IIA對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β1型Smads信號(hào)通路在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，28(5):539－542.

［5］王琳娜，陶立堅(jiān)，寧旺斌，等.依那普利對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的防治作用［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，33(9):841－848.

［6］于 力，郝志宏，王麗娜，等.IV型膠原和金屬蛋白酶組織抑制劑－1在腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)及福辛普利干預(yù)的意義［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2008，23(17):1330－1332.

［7］魏佳莉，王 暢，彭佑銘，等.黃芪對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響及其機(jī)制探討［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2009，10(8):664－667.

［8］秦 巖，李學(xué)旺，文煜冰，等.羅格列酮對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響［J］.中華腎臟病雜志，2005，21(7):394－398.

［9］楊麗霞，任 彬，李 彧，等.姜黃素對(duì) TGF－β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31(10):682－684.

［10］Shi Lijun，Zhang Zhengping，F(xiàn)ang Shuping，et al.Heat shock protein 90(Hsp90)regulates the stability of transforming growth factor beta－activated kinase 1(TAK1)in interleukin－1beta－induced cell signaling［J］.Mollmmunol，2009，46(4):541－550.

［11］Shi－wen X，Parapuram SK，Pala D，et al.Requirement of transforming growth factor beta－activated kinase 1 for transforming growth factor beta－induced alpha－smooth muscle actin expression and extracellular matrix contraction in fibroblasts［J］.Arthritis Rheum，2009，60(1):234－241.