喬寵，常瑞晶，王春輝

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，沈陽 110016）

坍塌反應調(diào)節(jié)蛋白1（collapsin response mediator protein-1，CRMP-1），也命名為二氫嘧啶酶/蛋白水解酶相關(guān)蛋白1（dihydropyrimidinase related protein-1，DRP-1 or dihydropyrimidinase-like1，DPYSL1），是坍塌反應調(diào)節(jié)蛋白（collapsin response mediator protein，CRMP）家族成員之一，在神經(jīng)系統(tǒng)表達最高，尤其是胚胎發(fā)育期，參與軸突引導、核苷堿基、核苷類、核苷酸和核酸代謝。近年來研究發(fā)現(xiàn)該蛋白參與突起生長、細胞變形和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移等過程［1］，本研究擬構(gòu)建該基因的表達載體，為進一步研究該蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移中的生物學作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coli Competent cell DH5a和p3x-FLAG-myc-CMV-24表達載體由中國科學技術(shù)大學微尺度實驗室孫斐教授提供；200DNA ladder marker，HindⅢ，SalⅠ限制性內(nèi)切酶，連接酶solutionⅠ以及一步PCR法試劑盒購自TaKaRa公司；PCR純化試劑盒購自Omega公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Axygen公司。細胞培養(yǎng)基DMEM、FBS、PBS購自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 CRMP1-p3x-FLAG-myc-CMV-24克隆載體構(gòu)建：從CRMP-1（GenBank序列號NM_001313；NP 001014809）基因的完整閱讀框（open reading frame，ORF）序列的兩端設計引物，上游引物為5′GGTCAAGCTTATGCGTACCAGGGCAAGA3′，下游引物為 5′ATGTCGACTCAACCGAGGCTGGTGATGTTG3′，引物中包含起始密碼子和終止密碼子，擴增目的基因片段長度為1 737 bp。將未經(jīng)過任何處理，且正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的10×106293T細胞按照Trizol法提取RNA，根據(jù)說明書操作，提取的RNA-80℃保存。依照RT-PCR反應試劑盒說明書，50μL體系PCR。反應條件變性50℃30 min，退火94℃2 min反轉(zhuǎn)錄cDNA，按94℃ 30 min，60℃ 30 s，72℃ 2 min共 30個循環(huán)進行PCR反應。PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收、純化?；厥债a(chǎn)物30μL。將帶有酶切位點的目的片段CRMP-1與之所要連接的載體p3x-FLAG-myc-CMV-24進行雙酶切，限制性內(nèi)切酶為HindⅢ和SalⅠ。37℃培養(yǎng)箱5h。用連接酶solutionⅠ，按照說明書進行，16℃1 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到制備的感受態(tài)E.coli中，涂布在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，將平板放入37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.2.2 鑒定：（1）提取質(zhì)粒及酶切鑒定：在平板上挑取4個單克隆點，接種于含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min搖菌過夜，離心收集菌液，使用Axygen公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，顯示4個克隆點均連接上目的片段，然后用HindⅢ和SalⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，顯示前3個泳道切出目的條帶，第4個泳道為構(gòu)建錯誤的片段，為進一步驗證所構(gòu)建載體的正確性，將前3個點所搖出的菌液送去測序；（2）測序：將酶切驗證正確的陽性克隆點搖菌37℃過夜，送菌液至英俊測序公司進行測序。

2 結(jié)果

從293T細胞中提取的總RNA可見3條帶（圖1），分別是 28 s，18 s，5 s，未見其余條帶，在轉(zhuǎn)化后，將挑取的單克隆點提取質(zhì)粒，如圖2，根據(jù)其大小位置與空載體的對比，證明基因片段已經(jīng)連接上.重組表達質(zhì)粒p3x-FLAG-myc-CMV-24/CRMP-1雙酶切鑒定，圖3可見2條帶，一條為質(zhì)粒的長度4.7 kb，目的片段1 737 bp，測序結(jié)果提示插入片段為目的片段，且進行基因同一性比較為99.9%，氨基酸同一性比較為100%，并且插入方向正確（圖4）。

圖1 提取的293TRNA電泳圖Fig.1 Extraction of 293 TRNA electrophoresis diagram

3 討論

圖2 CRMP-1基因真核重組質(zhì)粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24構(gòu)建Fig.2 Construction of the recombinant eukaryotic expression plazmid

圖3 質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.3 Plasmid electrophoresis figure after restriction enzyme cutting

圖4 CRMP-1測序結(jié)果圖Fig.4 CRMP-1 sequencing results

CRMP屬于磷酸蛋白家族，最先在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，認為其主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達［1］，特別是在胚胎生成時的神經(jīng)系統(tǒng)中［2］。目前研究一致認為，CRMP參與神經(jīng)突突起生長并引導其生長方向［3］。CRMP家族有5個同源性胞質(zhì)蛋白，生理上參與信號轉(zhuǎn)導，分別是 CRMP-1、CRMP-2、CRMP-3、CRMP-4和CRMP-5，最初的研究表明它們可參與神經(jīng)元分化和軸突引導，并且在這些成員中除CRMP-1之外的所有成員均有相互作用［4］。免疫細胞化學研究顯示：CRMP家族主要分布在生長錐的板狀偽足和絲狀偽足，軸突及神經(jīng)體中，CRMP-1、CRMP-4、CRMP-5發(fā)現(xiàn)主要在小鼠胚胎腦組織中表達，但在成年小鼠腦組織中卻很少檢測到。

最近研究表明：CRMP在神經(jīng)發(fā)育過程中可抑制軸突延伸，參與微管動力，延長細胞周期［5］，并可在肺癌細胞浸潤調(diào)節(jié)中形成一個類似的信號網(wǎng)絡?？梢哉f該家族蛋白能調(diào)節(jié)發(fā)育中的神經(jīng)細胞和血管系，使之幾乎可以浸潤任何組織。所以這些抑制行為普遍存在［6］。Zhang等［2］在鼠的腦中，發(fā)現(xiàn)CRMP（CRMP1、CRMP2和CRMP4）經(jīng)過磷酸化方式進行調(diào)節(jié)，通過磷酸化后產(chǎn)生生物學作用，這3個成員與嚴重外傷和神經(jīng)中毒相關(guān)，但是他們空間上和時間上的表達和磷酸化的分子機制仍不清楚。

CRMP-1是一個分子量為62 kDa的磷酸化蛋白。基因位于4號染色體上，全長1 719 bp，由14個外顯子組成。是CRMP家族成員之一，首先在神經(jīng)細胞中被發(fā)現(xiàn)，認為是腦中特異性蛋白，參與在神經(jīng)發(fā)育過程中誘導生長錐的衰亡［1，7］。通過原位雜交和免疫組化方法，發(fā)現(xiàn)CRMP-1在鼠胚胎小腦組織中高表達，最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在嗅球、下丘腦和視網(wǎng)膜中均有表達。在細胞分裂間期，運用熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)CRMP-1主要分布在胞質(zhì)，然而在某些細胞中CRMP-1既分布在胞質(zhì)也分布在胞核，同CRMP家族一樣，CRMP-1具體作用機制目前尚不清楚。

有關(guān)CRMP-1在神經(jīng)系統(tǒng)的生理作用主要有：（1）調(diào)節(jié)軸突引導的信號轉(zhuǎn)導和神經(jīng)細胞遷移：可能通過Cdk5磷酸化CRMP-1來調(diào)節(jié)參與大腦皮層中壁板蛋白semaphorin3A引導的脊柱發(fā)育［7］?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)Reln信號通路來調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞遷移。并參與神經(jīng)元增殖、分化、遷移和軸突導向［8］，在微管動力方面也起著重要的作用［9］。并可以感受到外界刺激引起神經(jīng)細胞衰亡，突觸萎縮及生長錐瓦解，作為信息傳遞的重要調(diào)節(jié)者，對細胞骨架的聚合作用有極大的影響；（2）CRMP-1證明與叢狀蛋白依賴的神經(jīng)功能有關(guān)?？赡軈⑴c了在成年海馬神經(jīng)突起的生長，有研究證明缺失CRMP-1可能會影響長時程的增強和空間學習和記憶［10］。

起初人們認為CRMP-1是在腦中是特異性的蛋白，但最近的研究表明人類CRMP-1基因表達水平可以影響腦外癌癥的浸潤和轉(zhuǎn)移。CRMP-1蛋白水平和癌癥浸潤、轉(zhuǎn)移的程度成負相關(guān)，Goshima等人通過使用肺癌細胞系CL1–5轉(zhuǎn)染并過表達CRMP-1基因，通過形態(tài)學和體外浸潤試驗以及體內(nèi)試驗，表明CRMP-1基因在癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起到一定的作用，可能是一種抑制癌細胞基因［11］，所以目前將CRMP-1基因定義為抑制浸潤基因。此后也有其他文獻報道，在CRMP家族中，只有CRMP-1有這種特殊的癌細胞抑制浸潤作用。研究發(fā)現(xiàn)CRMP-1 參與大鼠泌乳素瘤的浸潤［12］。Shih，Chu 等［1，13］研究，在肺腺癌患者中，低表達人CRMP-1基因的患者癌細胞浸潤更深以及存在遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，高表達人CRMP-1基因的患者則發(fā)病間隔時間和生存期明顯延長，Goshima，Chang 等［11，14］通過改良的細胞浸潤試驗以及動物模型測轉(zhuǎn)移活力試驗，表明CRMP-1可參與抑制人類肺腺癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)CRMP-1基因?qū)Ψ蜗侔┘毎慕欁饔每赡芡ㄟ^NF-kappaBp50負反饋來調(diào)節(jié)［15］。

目前僅CRMP-2、CRMP-5研究較多，人CRMP-1蛋白研究也僅限于基礎研究，其結(jié)構(gòu)域的作用不清楚，活性部位沒有鑒定出。CRMP-1在遷移和浸潤方面的作用，除了肺癌研究之外其他領(lǐng)域尚未涉及。我們構(gòu)建CRMP-1表達載體，為將來進一步研究該基因在其他領(lǐng)域中，尤其是在產(chǎn)科方面及子癇前期方面的生物學作用及用于臨床診斷和治療方面奠定基礎。［致謝：本課題在選題及研究過程中特別感謝中國科學技術(shù)大學生殖生物學實驗室孫斐老師為我提供了良好的研究條件，姚桂東、尹貽蒙、王貴栓、劉琳、陰綿綿等在實驗技術(shù)上的指導，謹向各位同仁表示誠摯的敬意和謝忱。］

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