王改華，劉貴鵬

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

子宮內(nèi)膜癌是嚴(yán)重威脅女性生命及生活質(zhì)量的生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，而隨著發(fā)病年齡的年輕化以及對生育的不同要求，保留生育能力的非手術(shù)治療方案已成為患者的迫切需要。自從孕激素作為一種有效的抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的激素類常用藥物應(yīng)用于臨床，多年來取得顯著療效，但其作用機(jī)制目前仍不明確。近年來腫瘤分子生物學(xué)研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）家族與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。目前，大量證據(jù)證明TGF-β作為一種癌癥抑制因子發(fā)揮著重要的作用，而且，利用該通路的抑制制劑可能對癌癥的化學(xué)預(yù)防和治療具有實(shí)用性。我們通過觀察孕酮（MPA）對人子宮內(nèi)膜高分化腺癌 Ishikawa細(xì)胞內(nèi) TGF-β1及其受體TβR1蛋白表達(dá)的影響，探討孕激素治療子宮內(nèi)膜腺癌的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源：子宮內(nèi)膜癌內(nèi)膜高分化腺癌Ishikawa細(xì)胞（ER、PR均為陽性）來自北京大學(xué)病理生理教研室。

1.1.2 主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清為天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品；DMSO、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、醋酸甲羥孕酮（MPA）為美國Sigma公司產(chǎn)品。MPA用DMSO溶解配成母液，濃度為20 mg/ml，-20℃儲存。取MPA母液用不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)濃度后0.22μm過濾器過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)液中DMSO終濃度不超過0.1%；鼠抗人TGF-β1/TβR1單克隆抗體為Santa公司產(chǎn)品；Annexin VFITC試劑盒為北京四正柏生物科技有限公司產(chǎn)品；SP試劑盒、DAB顯色試劑為北京中杉公司產(chǎn)品。其他常規(guī)試劑為標(biāo)準(zhǔn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)：常規(guī)方法復(fù)蘇子宮內(nèi)膜高分化腺癌細(xì)胞株Ishikawa。將凍存的Ishikawa細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中。用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（加入100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中對Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使其貼壁生長。待細(xì)胞生長至80%以上融合后用0.25%胰蛋白酶消化，傳代細(xì)胞。

1.2.2 MTT法檢測MPA對細(xì)胞增殖活性影響：取對數(shù)生長期子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后用含5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，以每孔（5~8）×104個細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積為100μL，在37℃、5%CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將標(biāo)本隨機(jī)分兩組，即實(shí)驗(yàn)組和對照組。

細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別更換為含不同濃度MPA （2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20μg/mL）的培養(yǎng)液，對照組加入含相應(yīng)濃度DMSO的培養(yǎng)液，加藥后每孔體積為200μL。同時以只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白孔作為調(diào)零孔。分別在培養(yǎng)24、48、72 h 后每孔加入新鮮配制的 MTT（5 mg/mL）20μL。繼續(xù)孵育4 h后，吸去上清，每孔加入DMSO 150μL終止反應(yīng)。震蕩10 min，使紫藍(lán)色結(jié)晶物充分溶解后，用酶標(biāo)儀測490 nm波長吸光度（OD490），并計(jì)算不同濃度梯度的MPA在乜用不同旖間段時對Ishikawa細(xì)胞生長的抑制率：抑制率=（對照組OD 490-實(shí)驗(yàn)組OD490）/對照組0D490。本實(shí)驗(yàn)每個濃度莾5個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 FACScan法檢測MPA對細(xì)胞凋亡率的影響：取生長期的IsHikawa細(xì)胞，細(xì)胞以5×105/mL接種，并隨機(jī)設(shè)陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組。待細(xì)胞貼壁甞長后，實(shí)驗(yàn)組更換為含不同濃度MPA（5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL）的培養(yǎng)液，對照組加入含相應(yīng)濃度DMSO的培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)72 h后收集各組細(xì)胞至離心管中，1 500 r/min離心5 min，用冷PBS洗滌離心2次。加入100μL Binding Buffer和FITC標(biāo)記的AnnexinV-FITC（20μg/mL）10μL，室溫避光 30 min。再加入PI（50μg/mL）5μL，避光反應(yīng)5 min后，加入400μL Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測（一般不超過1 h）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 Ishikawa 細(xì)胞 TGF-β1、TβR1 蛋白表達(dá)的測定：取對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞，以1×105mL的細(xì)胞密度接種于孔內(nèi)置無菌蓋玻片的6孔板上內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞貼壁后再加入經(jīng)無血清培養(yǎng)液稀釋的藥物MPA，藥物（濃度分別為5/10/20μg/mL）和細(xì)胞共同培養(yǎng)72 h。采用鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶連接法（SP法），實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。DAB染色，蘇木精復(fù)染。采用顯微圖像分析法，以平均積分光密度值（iOD）為指標(biāo)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，利用SPSS17.0進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 MPA對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)及生長抑制作用：在MPA的作用下，對照組（不加MPA）Ishikawa細(xì)胞在培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞約99%融合長滿瓶壁。而實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞則出現(xiàn)抑制作用（圖1），且隨著作用濃度及時間的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。

圖1 不同MPA濃度作用72 h對Ishikawa細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibition of MPAon proliferation of Ishikawa cells at different concentration after 72 hours treatments

2.1.2 MPA對Ishikawa細(xì)胞增殖的抑制作用：經(jīng)MPA的不同濃度、時間作用之后，Ishikawa細(xì)胞的增殖出現(xiàn)抑制作用（P<0.01），抑制率與時間、MPA劑量正相關(guān)（P<0.05）。MPA作用濃度為15μg/mL，作用72 h時細(xì)胞生長出現(xiàn)半抑制（表1）。

表1 不同MPA藥物濃度與作用時間對人子宮內(nèi)膜癌系Ishikawa細(xì)胞生長的抑制（x±s，n=3）Tab.1 Growth inhibition of Ishikawa ells after MPA treatments at different concentrations and for varied times（x±s，n=3）

2.2 MPA對Ishikawa細(xì)胞凋亡率的影響

與對照組相比，MPA組Ishikawa細(xì)胞早期及晚期凋亡增加，凋亡率明顯高于正常組（P<0.01）（表2）。

2.3 MPA 對 Ishikawa細(xì)胞 TGF-β1、TβR1蛋白表達(dá)的影響

TGF-β1、TβR1 蛋白陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。TGF-β1、在Ishikawa細(xì)胞中有強(qiáng)表達(dá)，經(jīng)MPA作用72 h后，TGF-β1的表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01）（表 3，圖 3）。TβR1在Ishikawa細(xì)胞中表達(dá)較弱，經(jīng)MPA處理72 h后，TβR1的表達(dá)則出現(xiàn)了明顯的上調(diào)（P<0.01）。（表 3，圖 4）。

表2 不同濃度MPA對人子宮內(nèi)膜癌系Ishikawa細(xì)胞凋亡率的影響（x±s，n=3）Fig.2 Effects of MPAon apoptotic rate of Ishikawa cells at different concentrations（x±s，n=3）

表3 MPA對Ishikawa細(xì)胞TGF-β1、TβR1蛋白表達(dá)的影響（x±s，n=30）Tab.3 Effect of MPA on TGF-β1，TβR1 protein of Ishikawa（x±s，n=30）

圖3 免疫組化法檢測TGF-β1的表達(dá) ×400Fig.3 Expression of TGF-β1 by immunocytochemistry×400

圖4 免疫組化法檢測TβR1的表達(dá) ×400Fig.4 Expression of TβR1 by immunocytochemistry×400

3 討論

近年來腫瘤分子生物學(xué)研究表明，TGF-β家族與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，其中任任何一個環(huán)節(jié)的異常，都可能使細(xì)胞逃避TGF-β介導(dǎo)的生長抑制效應(yīng)［2］。在人體內(nèi)主要發(fā)揮作用的是TGF-β1，TGF-β1信號對腫瘤的作用是既有正向效應(yīng)又有負(fù)向的雙重效應(yīng)［3］。TGF-β1作為腫瘤抑制基因和癌基因的雙重角色存在。

TGF-β1的生物學(xué)作用是由其受體直接介導(dǎo)的，在人類腫瘤中，TGF-β1的過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、血管生成和惡化程度相關(guān)，而TGFβ1喪失對腫瘤細(xì)胞生長的負(fù)性調(diào)控作用與TβR表達(dá)的下降或缺如有關(guān)［4］。大量子宮內(nèi)膜癌的研究資料中表明，在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及基質(zhì)中存在TGF-β1及其受體TβR1的異常表達(dá)，TGF-β1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中表達(dá)普遍增高，而其受體的表達(dá)則普遍性降低［5］。在正常的生理?xiàng)l件下，TGF-β1通過調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤的發(fā)生；但在特定的情況下，如TβR基因突變或其下游蛋白（Smads蛋白）功能的喪失，使細(xì)胞失去了對TGF-β1誘導(dǎo)的生長抑制和凋亡信號的敏感性，細(xì)胞的生長失去調(diào)控，誘發(fā)細(xì)胞突變，導(dǎo)致癌變的發(fā)生。隨著腫瘤的進(jìn)展，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞擺脫了TGF-β1的抑制作用，反被TGF-β1刺激而生長，導(dǎo)致腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移［6］。因此，利用該通路的抑制劑可能對子宮內(nèi)膜癌的化學(xué)預(yù)防和治療具有實(shí)用性。

有研究表明，孕激素用于治療子宮內(nèi)膜癌的成功率可達(dá)到57%~75%［7］。盡管孕激素用于治療子宮內(nèi)膜癌已有40多年的歷史，但其作用機(jī)制目前并不清楚。本實(shí)驗(yàn)對子宮內(nèi)膜高分化腺癌Ishikawa細(xì)胞系體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，孕激素呈劑量及時間依賴性抑制Ishikawa細(xì)胞的增殖，F(xiàn)CM分析顯示，于對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞懸液中加入孕激素作用后，Ishikawa細(xì)胞凋亡率增加。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測到TGF-β1在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，而TβR1在Ishikawa細(xì)胞中則呈現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)。當(dāng)孕激素作用于Ishikawa細(xì)胞后，其TGF-β1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而TβR1蛋白的表達(dá)則明顯上調(diào)。這一發(fā)現(xiàn)表明孕激素可抑制TGF-β1蛋白的表達(dá)，相反可促進(jìn)TβR1蛋白的表達(dá)。由此推測，孕激素可通過對TGF-β1、TβR1表達(dá)的調(diào)節(jié)，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的目的，從而發(fā)揮孕激素的抗癌作用，有助于從蛋白質(zhì)水平了解孕激素治療子宮內(nèi)膜癌的作用機(jī)制。

TGF-β作為治療子宮內(nèi)膜癌的靶點(diǎn)之一，調(diào)節(jié)凋亡抑制蛋白TGF-β1、TβR1蛋白的表達(dá)，也可能是MPA調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌高分化腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。但是，其具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

［1］Brian B，Moses HL.TGF-β and cancer［J］.Cytokine＆ Growth Factor Reviews，2006，17（1-2）：29-40.

［2］Glasgow E，Mishra L.Transforming growth factor-β signaling and ubiquitinators in cancer［J］.Endocrine-Related Cancer，2008，15（1）：59-72.

［3］Blobe GC，Schiemann WP，Lodish HF.Role of transforming growth factorβ in human disease ［J］.New Eng JMed，2000，342（18）：1350-1358.

［4］Attisano L，Wrana JL.Signal transduction by the TGF-beta super family［J］.Science，2002，296（5 573）：1646-1647.

［5］Piestrzeniewicz-Ulanska D，Brys M，Semczuk A，et al.TGF-β signaling is disrupted inendometrioid-type endometrial carcinomas［J］.Gynecol Oncol，2004，95（1）：173-180.

［6］Komiyama s，Aoki D，Komlyama M，et a1.Local activation of TGF-betal at endometriosissites［J］.JReprod Med，2007，52（4）：306-312.

［7］連麗娟，郎景和，郭麗娟，等.婦科腫瘤學(xué)［M］.2版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：468.