任昊，翟效月

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，沈陽 110001）

本實(shí)驗(yàn)室的前期實(shí)驗(yàn)表明，鐵螯合劑去鐵敏（desferoxamine，DFO）對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性肺炎鏈球菌性腦膜炎具有保護(hù)作用［1］。作為一種可變價(jià)的過渡金屬元素，鐵也能夠通過芬頓化學(xué)反應(yīng)促進(jìn)高活性羥自由基的形成而引起組織氧化損傷［2］。

鐵蛋白（ferritin）是由重（H-）和輕（L-）鏈亞基構(gòu)成的高分子蛋白，可存儲(chǔ)高達(dá)4 500分子鐵［3］。在不同的細(xì)胞類型中H-和L-鐵蛋白比例不同。H-鐵蛋白能夠在應(yīng)激的狀態(tài)下迅速被合成，而L-鐵蛋白負(fù)責(zé)機(jī)體內(nèi)鐵的長期儲(chǔ)備。由鐵蛋白結(jié)合的鐵不能再參與生物化學(xué)反應(yīng)，也就阻止了鐵介導(dǎo)的自由基形成。在某些條件下，如在pH值下降，自由鐵能夠從鐵蛋白釋放出來，使非結(jié)合鐵庫容量升高，增加氧化損傷的風(fēng)險(xiǎn)［4］。

本研究在大鼠腦膜炎模型中鐵穩(wěn)態(tài)的變化和自由鐵與鐵蛋白的共存關(guān)系，分析8-羥基鳥苷酸等氧化損傷指標(biāo)。揭示肺炎鏈球菌性腦膜炎的病理改變（特別是大腦過氧化損傷）和大腦皮質(zhì)中自由鐵的增加的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

生后11 d的Wistar大鼠40只（瑞士伯爾尼大學(xué)動(dòng)物中心），隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（n=20）。5×106/mL肺炎鏈球菌（血清型3）在硬膜下感染動(dòng)物，對(duì)照組注射等量生理鹽水。18 h后對(duì)仔鼠進(jìn)行臨床分?jǐn)?shù)評(píng)估，未感染鼠棄用（感染率大于95%）。動(dòng)物用戊巴比妥麻醉，冰磷酸鹽緩沖液灌流后解剖大腦立即液氮冷凍保存，用于定量分析。用于形態(tài)學(xué)研究的大腦用4%福爾馬林左心室灌流固定后，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 腦鐵含量測量

自由鐵的定量應(yīng)用Ferene-S方法［5］，使用商用試劑盒（DiaSys，Holzhelm，德國）。冰凍大腦皮質(zhì)在冰Tris緩沖液中（pH值7.4）1∶2.5勻漿，離心。0.25 mL上清液與等量Ferene-S溶液在室溫孵育20 min后，在波長595 nm處測定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算自由鐵含量。血漿及腦脊液的自由鐵采用96孔板測量，使用同樣比例的樣本和試劑。

1.3 鐵蛋白的免疫組織化學(xué)定位

脫石蠟切片用5%牛血清白蛋白封閉后，在一抗溶液中 37 ℃孵育 1 h（1∶100）；H-和 L-型鐵蛋白特異性抗體由Dr.James Connor提供（賓夕法尼亞州立大學(xué)，美國）。免疫反應(yīng)使用由金屬增強(qiáng)的鏈霉親和素法，用化學(xué)發(fā)光劑二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenizidine，DAB）可視化［6］。

1.4 鐵蛋白的免疫印跡定量分析

冷凍的大腦皮質(zhì)組織按1∶9與蛋白酶抑制劑溶液混合勻漿（Rosche diagnosis，Basel，瑞士），離心后測定上清蛋白濃度。20μg蛋白上樣，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（13%）電泳分離。分離蛋白被轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上后在4℃下與抗體進(jìn)行孵育。H-和L-鐵蛋白一抗用1∶500濃度，二抗使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔IgG抗體（1∶10 000）。用增強(qiáng)化學(xué)熒光劑（enhanced chemiluminescence，ECL）可視化后進(jìn)行定量分析。

1.5 免疫熒光分析RNA的原位氧化

為了分析RNA原位氧化，切片在單克隆抗體中孵育（15A3，QED，California，美國）。二抗使用 Alexa 488標(biāo)記的羊抗鼠熒光抗體（1∶500）。為了去除DNA氧化信號(hào)，切片首先用DNase處理。為了盡量減少自然氧化干擾信號(hào)，腦切片和染色均在氬氣Ar534中進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量指標(biāo)以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 腦膜炎大腦自由鐵的改變

在感染后的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)（圖1）自由鐵水平逐漸提高，相較于未感染對(duì)照組，在感染后22 h顯著增加約1.5倍。相比之下，血漿及腦脊液在感染后自由鐵含量與對(duì)照組未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［（0.87±0.30）μg/mL與（0.29± 0.12）μg/mL］。這些結(jié)果表明，腦膜炎感染相關(guān)的自由鐵的增加來源于大腦實(shí)質(zhì)而不是血液。

圖1 腦皮質(zhì)自由鐵隨感染的時(shí)程變化Fig.1 Time course of cortical free iron production

2.2 免疫組織化學(xué)檢測鐵蛋白的分布特征和細(xì)胞定位

由于鐵蛋白由H-和L-兩種類型構(gòu)成，本實(shí)驗(yàn)分別調(diào)查了他們?cè)诜窝祖溓蚓X膜炎中的變化（感染后22 h）。H-鐵蛋白在未受感染的動(dòng)物大腦皮質(zhì)中有中等程度的陽性染色（圖2A）。感染引起了H-鐵蛋白表達(dá)的顯著增加，陽性信號(hào)主要分布在神經(jīng)元胞體（圖2B，實(shí)心箭頭），血管（圖2B，空心箭頭）和皮質(zhì)的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞（圖2B，三角）。L-型鐵蛋白染色在未受感染的皮質(zhì)相對(duì)較低（圖2C）。受感染時(shí)，L-型鐵蛋白染色在小膠質(zhì)細(xì)胞中明顯增加（圖2D，三角），在血管上染色也略有增加（圖2D，箭頭）。

圖2 H-和L-鐵蛋白在腦膜炎大腦皮質(zhì)的分布特征 ×400Fig.2 H-and L-ferritin expression pattern and cellular localization in the brain×400

2.3 鐵蛋白表達(dá)的時(shí)程曲線

用Western blot檢測的結(jié)果表明，伴隨著感染的進(jìn)程，H-和L-鐵蛋白表達(dá)都上調(diào)，并且其時(shí)程變化曲線與自由鐵增加的變化相吻合。H-型鐵蛋白在感染后16 h達(dá)到高峰，與對(duì)照組比較顯著增加達(dá)4倍，而L-型鐵蛋白在8 h時(shí)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 H-和L-鐵蛋白含量在腦膜炎過程中的時(shí)程變化Fig.3 Time course of H-and L-ferritin protein expression

2.4 RNA氧化指標(biāo)檢測

利用免疫熒光定位分析發(fā)現(xiàn)，RNA氧化指標(biāo)并沒有隨感染而改變。不論在經(jīng)過DNase處理的（圖4C，D）還是在沒經(jīng)過 DNase處理的（圖 4A，B），腦切片中8-OhdG的陽性信號(hào)強(qiáng)度都不變。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DNase是為了去除DNA氧化信號(hào)的影響。

圖4 未感染組和腦膜炎組大腦皮質(zhì)內(nèi)的RNA過氧化分析 ×400Fig.4 Effect of pneumococcal meningitis on cortical RNA oxida tion×400

3 討論

細(xì)菌性腦膜炎仍然是威脅發(fā)展中國家嬰幼兒生命的疾病之一［7］。本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)證明鐵螯合劑去鐵敏對(duì)細(xì)菌性腦膜炎有治療作用。本研究結(jié)果表明腦膜炎伴隨著大腦皮質(zhì)自由鐵的產(chǎn)生，該腦鐵的增加是腦源性的，與血液和腦脊液無關(guān)。H-和L-型鐵蛋白的增加可能通過結(jié)合大量的自由鐵而保護(hù)大腦免于過氧化損傷。

已有研究表明，鐵蛋白受鐵離子的翻譯后調(diào)控（post-translational regulation）［8］，本實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。在空間分布上，H-和L-型鐵蛋白表達(dá)與自由鐵在腦中的表達(dá)有共存性，即自由鐵的增加主要表現(xiàn)在神經(jīng)元，血管和小膠質(zhì)細(xì)胞上，這與鐵蛋白的表達(dá)吻合。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力說明，增加的自由鐵很可能是被增加的鐵蛋白吸收而沒有參與到自由基反應(yīng)當(dāng)中。RNA氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)。

自由鐵的來源有可能是通過血液里的外源性鐵移動(dòng)到大腦內(nèi)的，但在血液和腦脊液中對(duì)自由鐵的測量結(jié)果沒有改變，因而排除了這種可能性。血紅素結(jié)合的鐵是組織內(nèi)結(jié)合鐵的另外一種形式，因此腦內(nèi)自由鐵可能來源于血紅素鐵的釋放，即血紅素氧合酶（hemoxygenase）分解血紅素卟啉環(huán)釋放出鐵［9］，該機(jī)制是否導(dǎo)致腦內(nèi)自由鐵的增加還有待進(jìn)一步研究。

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