梁秀云，林蓓，劉娟娟，高利利，王燕燕，劉大我，嚴麗梅，張淑蘭

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

卵巢癌發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位，近年有上升趨勢。由于卵巢腫瘤發(fā)病和進展隱匿，確診時70%已屬晚期，晚期卵巢癌5年生存率僅約30%［1］。卵巢癌浸潤、轉(zhuǎn)移、耐藥是造成卵巢癌治療困難的主要原因。巖藻糖基可參與構成某些重要黏附分子的糖鏈結構，在腫瘤的增殖、黏附及轉(zhuǎn)移機制上起重要作用［2~4］。Lewisy抗原是含有雙巖藻糖的寡糖，一些腫瘤標志物的分子結構中如卵巢癌相關標志物CA125和MUC-1也含有Lewis y結構，說明Lewisy抗原與上皮性卵巢癌有關［5］。我們的前期工作中利用基因轉(zhuǎn)染技術建立了α1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（α1，2-fucosyltransferases，α1，2-FT） 基因及Lewis y抗原高表達的卵巢癌細胞RMG-I-H，轉(zhuǎn)染后細胞的惡性生物學行為明顯增強［6］。由于Lewisy抗原位于細胞表面，在生物檢測和生物治療方面有著廣闊的應用遠景。

本研究通過檢測α1，2-FT基因FUT1轉(zhuǎn)染前后的人卵巢癌細胞系RMG-I和RMG-I-H、人卵巢癌高轉(zhuǎn)移細胞系HO8910PM及親本細胞系HO8910、人卵巢癌耐藥細胞系COC1/DDP及親本細胞系COC1中Lewis y抗原及FUT1基因的表達，進一步證明Lewis y抗原與腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移關系，為我們進一步研究Lewis y抗原對卵巢癌細胞增殖的影響及作用機制，為研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制奠定基礎，為卵巢癌的早期診斷及靶器官治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人卵巢癌細胞系RMG-I細胞來自人卵巢透明細胞癌組織，由日本近畿大學巖森正男教授惠贈；RMG-I-H 細胞為 α1，2-FT（FUT1）及 Lewis y抗原穩(wěn)定高表達卵巢癌細胞系，在我們前期研究中已建立［8］；人卵巢癌細胞株HO8910PM、HO8910、COC1/DDP和COC1購于中國科學院上海細胞生物研究所。

1.1.2 主要材料與儀器：DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國GIBCO公司產(chǎn)品）；鼠抗人Lewis y單克隆抗體（英國Abcam公司）；TRITC標記的兔抗小鼠IgG抗體（DAKO公司產(chǎn)品）；SP試劑盒（福州邁新公司）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程公司）；Trizol試劑，PrimeScriptTMRTreagent kit、SYBR誖Premix Ex TaqTM購于大連TaKaRa生物工程公司；引物序列由上海Invitrogen公司合成；其余化學藥品均為國產(chǎn)分析純；臺式低溫超速離心機3-16K（美國Sigma-Aldrich公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；電泳槽（美國Bio-Rad公司）；自動凝膠成像分析儀GDS8000（美國 UVP 公司）；PCR 擴增儀（480，2400，9600型）（美國PerkinElmer公司）；紫外分光光度儀（UV300，PYE-WNICAM/SPECTRONIC）（上海生物儀器廠）；倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)IX70（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：RMG-I和RMG-I-H細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)；HO8910PM和HO8910人卵巢癌細胞株接種于含10%小牛血清的RpMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；COC1（懸浮生長）培養(yǎng)于37℃，5%CO2，含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中。COC1/DDP（懸浮生長）順鉑耐藥細胞株，應用藥物連續(xù)作用并逐步提高藥量的遞增壓力選擇法，在同樣的條件下使其能在0.5 pg/mL順鉑的1640培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。

1.2.2 細胞總RNA提取：取以上6種細胞（各約1×107個細胞）加1 mLTRIZOL試劑，室溫放置5~10 min以裂解細胞，收集裂解液于Eppendorf管，一步法提取細胞總RNA。紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。按照大連TaKaRa生物工程公司RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。經(jīng)紫外分光光度計測量cDNA濃度和純度。證明合成的cDNA適用于下一步的實時PCR分析。

1.2.3 Quantitative RT-PCR檢測：利用Quantitative RT-PCR測定以上6種細胞中FUT1基因及內(nèi)源對照3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因表達水平。FUT1 PCR引物序列為 F：5′AGGTCATCCCTGAGCTGAAACGG 3′；R：5′CGCCTGCTTCACCACCTTCTTG3′。GAPDH引物序列為 F：5′GGACTTCGAGCAAGAGATGG3′；R：5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3′。實時熒光定量PCR反應體系包括：SYBR誖Premix Ex TaqTM（2×）5 μl，PCR Forward Primer（5 μmol/L）0.5 μL，PCR Reverse Primer（5μmol/L）0.5μL，cDNA 1μL，dH2O 3 μL。反應條件為：95 °C 變性 20 s，60°C 退火 60 s，共45個循環(huán)。應用Light Cycler PCR檢測系統(tǒng)（Roche Diagnostics，Mannheim，德國）進行 Real-time PCR 擴增并檢測各范本的Ct值。擴增完畢后，進行溶解曲線分析。目的基因表達倍數(shù)的改變利用2－ΔΔCT法進行計算。2－ΔΔCT結果＞1.4 或者＜0.6 被認為是有意義。

1.2.4 RT-PCR檢測：各取4μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應條件為50℃30 min，95℃5 min，5℃5 min。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μL行PCR擴增，反應體系為：10×緩沖液2.5μL，2.5 mmol/L脫氧核苷三磷酸2 μL，5 U/μL 的 Taq聚合酶 0.2μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 2.5μL，H2O 16.8μL，總體積 25μL；反應條件為：94℃，5 min后，94℃，40 s；退火溫度，62℃，1 min；72℃，1 min，最后為 72℃，7 min，35循環(huán)。PCR產(chǎn)物在3.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳后，經(jīng)電泳凝膠成像分析儀ALPHA IMAGER 5500拍照并分析處理。β-actin 引物序列為 F：5′GGACTT-CGAGCAAGAGATGG3′；R：5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3′擴增片斷長度，404 bp。

1.2.5 免疫細胞化學檢測：取RMG-I-H和RMG-I、HO8910PM和HO8910細胞爬片，4%多聚甲醛固定。免疫細胞化學染色方法按SP試劑盒說明書進行。Lewis y單抗 AH6，1∶100稀釋；IgM 二抗，1∶100稀釋。以細胞質(zhì)、細胞膜有棕黃色顆粒著色為陽性。實驗重復3次。圖像分析軟件Meta Morph分析結果。

將懸浮細胞COC1/DDP和COC1分別放入離心管中，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗2次，用少量的PBS把細胞涂于預先用多聚賴氨酸處理好的載玻片上，玻片待干燥時用4%多聚甲醛固定。其余步驟同上。

1.2.6 免疫細胞熒光檢測：細胞爬片和涂片同免疫細胞化學。4%多聚甲醛固定20 min，用PBS洗2次，每次3 min，5%BSA封閉30 min，加入一抗（抗Lewisy 1∶100）。4℃過夜。二抗TRITC標記的兔抗小鼠IgG單抗，1∶50稀釋，避光37℃1 h，暗室內(nèi)40倍鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件，檢測數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3對細胞系中Lewisy抗原的表達

SP染色結果表明，Lewis y分布于細胞膜和細胞質(zhì)，Lewis y在 RMG-I、HO8910、COC1 細胞中染色陽性顆粒呈淡黃色，分布彌散，累積光密度分別為（32.18±0.64），（14.96±0.61）和（19.26±0.83）（圖 1），在 RMG-I-H、HO8910PM和COC1/DDP細胞中，染色陽性顆粒呈棕黃色或棕褐色，分布廣泛，其累積光密度分別為（53.90±4.33），（37.31±0.19）和（28.52±1.45）。均比相應的RMG-I、HO8910、COC1細胞明顯增強（P均<0.05）。在相同的瀑布強度下免疫細胞熒光檢測結果顯示RMG-I-H、HO8910PM和COC1/DDP細胞中熒光強度明顯強于RMG-I、HO8910、COC1細胞（圖2）。

圖 1 RMG-I和 RMG-I-H、HO98910和 HO8910PM、COC1和COC1-DDP細胞系中Lewis y的表達×400Fig.1 Lewis y expression in RMG-Iand RMG-I-H，HO98910 and HO8910PM，COC1 and COC1-DDP celllines×400

圖 2 RMG-I和RMG-I-H、HO98910和HO8910PM、COC1和COC1-DDP細胞系中Lewis y的表達×400Fig.2 Immunofluorescence microscopy of Lewis y carbohydrate determinants from RMG-I-H and RMG-I，HO98910 and HO8910PM，COC1 and COC1-DDP ovarian carcinoma cells×400

2.2 3對細胞系中FUT1基因的表達

Real-time PCR檢測結果證明，RMG-I-H細胞中FUT1的mRNA相對表達量較RMG-I細胞升高了3.07倍（P<0.05），HO8910PM細胞中的相對表達量較HO8910細胞升高了2.13倍（P<0.05），COC1/DDP細胞中相對表達量比COC1細胞升高了2.42倍（P<0.05）（表1）。RT-PCR檢測結果顯示RMG-I-H、HO8910PM和 COC1/DDP細胞中 FUT1基因的相對表達明顯強于RMG-I、HO8910、COC1細胞中FUT1基因的表達（圖3）。

表1 實時定量PCR測定6種細胞中FUT1基因的表達水平Tab.1 Real-time PCR determine the gene expression of FUT1 in these six cells

圖 3 RMG-I和 RMG-I-H、HO8910和 HO8910PM、COC1和COC1/DDP中FUT1 mRNA的相對表達Fig.3 The mRNA expression of FUT1 in RMG-I and RMG-I-H，HO8910 and HO8910PM，COC1 and COC1/DDP cell lines

3 討論

近年來，越來越多的研究表明糖復合物上的糖鏈結構參與調(diào)節(jié)細胞功能，如信號轉(zhuǎn)導、分子黏附等，與細胞生長、凋亡、運動、分化等重要生命過程密切相關［8~10］。細胞癌變后細胞膜上的糖復合物、特別是糖鏈部分發(fā)生結構和量的變化。卵巢癌主要表現(xiàn)為Ⅱ型糖鏈的改變，如Lewisy抗原。研究表明75%的上皮性卵巢癌出現(xiàn)Lewis y不同程度的過量表達，且增高的患者預后不良［11，12］。

Lewis y抗原是某些糖蛋白和糖脂的末端寡糖，為雙巖藻糖寡糖，其化學結構為［Fuc1→2Gal1→4（Fuc 1→3）GlcNAc］，即糖鏈非還原末端的二糖-半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖（Gal-N-GlcNAc），在其外側的半乳糖上連接有α1→2巖藻糖（Fuc）及α1→3巖藻糖（Fuc）而形成。研究證實，α1，2-FucT 中FUT1是Lewisy寡糖的特異性合成酶 FUT1［14］。

前期我們利用基因轉(zhuǎn)染技術將FUT1導入人卵巢癌細胞系RMG-I，首次建立了α1，2-FT基因及l(fā)ewisy穩(wěn)定高表達的卵巢癌細胞模型RMG-I-H。并且證明在卵巢癌細胞RMG-I-H中，α1，2-FT基因及Lewisy抗原使其增殖、侵襲等惡性細胞生物學能力增加的同時，對卵巢癌化療中的常用藥物卡鉑、5-氟尿嘧啶及紫杉醇的耐藥性也提高［2，4，6］。基因轉(zhuǎn)染后細胞系RMG-I-H與RMG-I相比，RMG-I-H中的多藥耐藥相關蛋白1、多藥耐藥相關蛋白2、蛋白激酶C-α及拓撲異構酶Ⅰ的基因表達均明顯上調(diào)，在RMG-I-H及其裸鼠移植瘤中P-gp在基因和蛋白水平表達都明顯增高［14］。Lewis y抗體能明顯抑制體內(nèi)外細胞的生物學特性的改變［15］。Chhieng等［16］用免疫組化法分別檢測了在原發(fā)性卵巢癌及轉(zhuǎn)移灶組的Lewisy表達，發(fā)現(xiàn)Lewisy抗原的表達在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶無明顯差異。這些結果證實，Lewisy抗原在卵巢癌的惡性生物學行為中扮演重要角色，與卵巢癌細胞耐藥和轉(zhuǎn)移能力有關。本實驗結果表明，在RMG-I-H中，Lewisy抗原和FUT1基因高表達使其在增殖和耐藥及侵襲能力上都比RMG-I增強；而人高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞HO8910PM中，Lewis y抗原及FUT1基因的表達都較其親本細胞HO8910中的表達量升高，Lewis y抗原升高1.6倍，F(xiàn)UT1基因升高2.13倍（P均<0.05）；在人耐藥卵巢癌細胞COC1/DDP中，Lewisy抗原及FUT1基因的表達量也較其親本細胞COC1中的表達量升高，Lewis y抗原升高1.6倍，F(xiàn)UT1基因升高了2.42倍。FUT1基因及l(fā)ewis y抗原高表達可導致腫瘤細胞增殖和耐藥及侵襲能力增強，而在高轉(zhuǎn)移能力及耐藥的腫瘤細胞中同樣檢測到有FUT1基因及Lewis y高表達。不難推斷FUT1基因及Lewisy抗原在卵巢癌細胞中的表達比較普遍，可能作為共性參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后。

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