劉言厚，徐 玲，劉云鵬*，曲秀娟，湯華麗，張 曄，侯科佐

(1莊河市中心醫(yī)院，遼寧莊河 116400;2中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)能激活細(xì)胞膜表面的死亡受體 5(DR5)，從而啟動內(nèi)源性、外源性凋亡通路并活化下游的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]。有研究報道，紫杉醇能改變 DR5的蛋白表達(dá)，從而增強前列腺癌細(xì)胞對 TRAIL的敏感性[2，3]，能否改變胃癌SGC7901細(xì)胞對 TRAIL的敏感性鮮見報道。2010年 3～10月，我們觀察了紫杉醇對 TRAIL誘導(dǎo)的胃癌 SGC7901細(xì)胞凋亡的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌 SGC7901細(xì)胞來源來自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。重組人 TRAIL購于美國 Cytolab/Peprotech Asia公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購于 Gibco公司，胎牛血清購于天津血液病研究所，甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、碘化丙啶(PI)購于 Sigma公司，核糖核酸酶A(RNase A)購于 AMRESCO公司，DR5、Actin抗體購于 Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ECL顯色發(fā)光試劑盒購于 PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將胃癌 SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)在含有 10%胎牛血清、12 U/ml慶大霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，于 37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化液消化傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測 采用 MTT法。將胃癌SGC7901細(xì)胞接種于 96孔板內(nèi)，之后加入 0.10～50.00μg/ml的紫杉醇，或分別加入 TRAIL(100 ng/ml)和紫杉醇(7.19μg/ml)。空白對照組和陰性對照組加入等量的培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 20 h后，每孔加入 5 mg/ml MTT 25μl，孵育 4 h后吸去上清，每孔加入 200μl二甲亞砜，振蕩搖勻。用酶標(biāo)儀于570 nm波長條件下測定吸光度值。按下列公式計算細(xì)胞增殖抑制率:增殖抑制率(%)=[1-(處理組平均吸光度值 -空白對照組平均吸光度值)/(陰性對照組平均吸光度值 -空白對照組平均吸光度值)]×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞儀分析法。將胃癌 SGC7901細(xì)胞接種于 6孔板內(nèi)，之后分別加入 TRAIL(100 ng/ml)和紫杉醇(7.19μg/ml)。24 h后分別收集對照組及處理組細(xì)胞，70%乙醇固定過夜 ，加入 20μg/ml RNase A，37 ℃孵育 30 min，再加入 20μg/ml PI避光孵育 15 min，用 FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布的檢測。

1.2.4 Western blot法檢測 DR5蛋白 將收集的對照組和處理組細(xì)胞裂解于 200μl含有蛋白酶抑制劑(100μg/ml苯甲基磺酰氟 ，2 μg/ml Aprotitin)的細(xì)胞組織快速裂解液中[0.1%SDS，1%Triton-100，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)，10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)]，4℃裂解 40 min，15 000 r/min離心 20 min，取上清，Lowry法進(jìn)行蛋白定量。與 3倍樣品緩沖液混合后，煮沸 5 min。將50μg/L的樣品在 10%的 SDS-聚丙烯凝膠中進(jìn)行電泳 3 h，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上(電壓:2 mV/cm2，時間:40 min)。用 5%脫脂牛奶封閉 2 h后，按預(yù)染 Marker標(biāo)記的分子量剪裁轉(zhuǎn)印膜，加入 DR5、Actin抗體，4℃過夜。含吐溫的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水洗 4次后加入二抗室溫作用 30 min，ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果以±s表示。計量資料比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇對 TRAIL誘導(dǎo)胃癌 SGC7901細(xì)胞的增殖抑制作用 MTT結(jié)果顯示，0.10～50.00μg/ml的紫杉醇處理胃癌 SGC7901細(xì)胞 24 h，紫杉醇以劑量依賴性方式抑制胃癌 SGC7901細(xì)胞增殖，24 h抑制細(xì)胞增殖 50%的藥物濃度(IC50)是(7.19±1.13)μg/ml。100 ng/ml的 TRAIL作用胃癌 SGC7901細(xì)胞24 h，對細(xì)胞的增殖抑制率為(6.27±2.14)%;紫杉醇(7.19 μg/ml，24 h的 IC50劑量)單藥作用胃癌SGC7901細(xì)胞，對細(xì)胞的增殖抑制率為(48.05±4.65)%。與單藥紫杉醇相比，紫杉醇聯(lián)合 TRAIL對細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增加，抑制率達(dá)到(69.24±5.33)%(P＜0.05)。

2.2 紫杉醇對 TRAIL誘導(dǎo)胃癌 SGC7901細(xì)胞凋亡作用 流式細(xì)胞儀顯示，100 ng/ml的 TRAIL作用胃癌 SGC7901細(xì)胞 24 h，細(xì)胞凋亡率只有(3.76±1.46)%;紫杉醇(7.19μg/ml)作用胃癌 SGC7901細(xì)胞 24 h，主要誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生 G2～M期阻滯，周期阻滯率達(dá)到(32.90±4.89)%。紫杉醇(7.19μg/ml)聯(lián)合 TRAIL(100 ng/ml)作用胃癌 SGC7901細(xì)胞 24 h，發(fā)生 G2～M期阻滯的細(xì)胞減少，但凋亡細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞凋亡率達(dá)到(35.17±4.31)%(P＜0.05)。

2.3 紫杉醇對 TRAIL誘導(dǎo)胃癌 SGC7901細(xì)胞 DR5蛋白表達(dá)的影響 100 ng/ml的 TRAIL作用SGC7901細(xì)胞 24 h，對 DR5的蛋白表達(dá)沒有影響。見圖1B。7.19μg/ml紫杉醇作用于胃癌 SGC7901細(xì)胞 8 h，DR5的蛋白表達(dá)輕度上調(diào);將作用時間延長至 24 h，DR5的蛋白表達(dá)進(jìn)一步提高。見圖1A。與單藥紫杉醇相比，7.19μg/ml紫杉醇和 100 ng/ml TRAIL聯(lián)合作用 SGC7901細(xì)胞 24 h，DR5的蛋白表達(dá)同樣明顯上調(diào)(P＜0.05)。見圖1B。

3 討論

TRAIL作為生物制劑能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但研究顯示 ，胃癌SGC7901細(xì)胞對TRAIL耐藥，其耐藥機制不明[4]。因此，提高胃癌細(xì)胞對TRAIL的敏感性十分必要。有研究顯示，順鉑、表柔比星等化療藥與 TRAIL聯(lián)合應(yīng)用，可明顯提高腫瘤細(xì)胞對 TRAIL的敏感性[5，6]，其機制尚未完全清楚。DR5作為 TRAIL的膜受體，與 TRAIL結(jié)合后能募集下游凋亡相關(guān)信號分子，從而啟動凋亡通路。因此，DR5是 TRAIL啟動凋亡的關(guān)鍵因子。

圖1 紫杉醇和 TRAIL對SGC7901細(xì)胞中 DR5蛋白表達(dá)的影響

紫杉醇作為一種高活性的抗腫瘤藥物，在胃癌的臨床治療中取得了很好的療效，在惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中，紫杉醇和 TRAIL有協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)[7～9]。Gong等報道，紫杉醇通過上調(diào) DR5的表達(dá)，從而提高了結(jié)腸癌細(xì)胞對 TRAIL的敏感性[10]。Nguyen的研究顯示，紫杉醇提高了胸部腫瘤細(xì)胞對 TRAIL的敏感性，但紫杉醇并沒有改變細(xì)胞中 DR5的水平[11]。因此，在不同的腫瘤細(xì)胞中，紫杉醇對 DR5表達(dá)的影響并不一致。本研究結(jié)果顯示，紫杉醇能通過上調(diào) DR5的蛋白表達(dá)，從而增強了胃癌 SGC7901細(xì)胞對 TRAIL的敏感性。本文結(jié)果還表明，紫杉醇明顯增強了 TRAIL對胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖抑制作用。盡管紫杉醇對細(xì)胞凋亡沒有明顯影響，但紫杉醇使胃癌 SGC7901細(xì)胞發(fā)生了 G2～M期阻滯。紫杉醇和 TRAIL聯(lián)合作用SGC7901細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率明顯提高，提示紫杉醇和TRAIL聯(lián)合對胃癌 SGC7901細(xì)胞的殺傷作用增強。

總之，紫杉醇很可能通過上調(diào) DR5蛋白的表達(dá)，從而增強 TRAIL對胃癌 SGC7901細(xì)胞的殺傷作用。紫杉醇和 TRAIL的聯(lián)合應(yīng)用能夠逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對 TRAIL的耐藥。

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