李爭(zhēng)明，劉 紅*，黃庶識(shí)，榮 曦，鄺曉聰

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021;2廣西科學(xué)院;3廣西醫(yī)科大學(xué))

拉曼光譜技術(shù)是一種新的研究凋亡細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)和含量變化的有效手段。近年利用其分析研究人肺癌 A549細(xì)胞及胃癌細(xì)胞的凋亡已有報(bào)道[1]，但對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。2010年4～9月，我們觀察了隨著細(xì)胞凋亡率的增加拉曼光譜的變化情況，并探討了拉曼光譜在正常與高糖誘導(dǎo)后凋亡的 NIT-1細(xì)胞的差別。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將 NIT-1細(xì)胞(β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞來(lái)源于 NOD小鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)夏寧教授惠贈(zèng))培養(yǎng)于含 15%胎牛血清、1×105U/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素的葡萄糖濃度為 11.1 mmol/L RPMI 1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞在相對(duì)濕度為95%、37℃、5%CO2的環(huán)境中單層生長(zhǎng)，每隔 2～3 d換液;4～5 d傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)不同葡萄糖濃度及不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì) NIT-1細(xì)胞分組，處理前細(xì)胞即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為 NG0;對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，以 1×105/ml密度接種，培養(yǎng) 24 h后分為:NG1(正常濃度葡萄糖培養(yǎng)第 2天)、NG2(正常濃度葡萄糖培養(yǎng)第 4天)、HG1(高糖培養(yǎng)第 2天)、HG2(高糖培養(yǎng)第 4天)、HG3(高糖培養(yǎng)第 4天漂浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞)。每組重復(fù) 6個(gè)樣本。

1.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡 收集按上述分組處理的各組細(xì)胞，細(xì)胞染色及流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡率，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 細(xì)胞拉曼光譜的測(cè)定 為了獲得單個(gè)細(xì)胞的整體光譜，采用激光點(diǎn)動(dòng)態(tài)掃描模式，激光點(diǎn)在一個(gè)周期內(nèi)分別向 X軸橫向和 Y軸縱向運(yùn)動(dòng)，掃描頻率被設(shè)定為 1 Hz，以 20 mW激發(fā)功率和 30 s曝光時(shí)間進(jìn)行光譜采集。從各組細(xì)胞中隨機(jī)選取一部分用于拉曼光譜的檢測(cè)。檢測(cè)流程:加樣，隨機(jī)選取視野，視野中每個(gè)細(xì)胞均檢測(cè)，PI染色法區(qū)分死亡細(xì)胞并舍棄，重復(fù)以上操作直到獲得 50個(gè)非死亡細(xì)胞的數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，并用SNK法做兩兩比較。光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)背景扣除、平滑、基線校正、歸一化、峰面積計(jì)算(峰面積:峰最高點(diǎn)的前 4個(gè)與后4個(gè)拉曼位移的強(qiáng)度之和)等處理，以光譜峰面積作為計(jì)量資料，數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)表示，多組間差異比較采用 Kruskal-Wallis法進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率的比較 見(jiàn)表1。

表1 各組 NIT-1細(xì)胞凋亡率的比較(%，±s)

表1 各組 NIT-1細(xì)胞凋亡率的比較(%，±s)

注:HG1與 NG1、HG2與 NG2比較，*P＜0.01;與 NG0組比較，△P＜0.01;與 HG1組比較，﹟ P＜0.01;與 HG2比較，▼ P＜0.01

組別 n 細(xì)胞凋亡率NG0 6 6.09±0.48 NG1 6 10.70±0.99△NG2 6 12.96±4.62△HG1 6 21.26±0.63△*HG2 6 35.21±4.80△*﹟HG3 6 98.22±1.95△﹟▼

2.2 細(xì)胞拉曼光譜的變化情況 比較 714/cm、781/cm、1 001/cm、1 086/cm、1 337/cm、1 447/cm、1 655/cm各峰的峰面積后發(fā)現(xiàn)，隨著高糖培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡率的增加 1 001/cm峰(指認(rèn)苯丙氨酸[2])和 1 337/cm峰(指認(rèn)腺嘌呤[2])峰面積呈降低的趨勢(shì)(P＜0.05)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 各組隨著凋亡率的增加平均光譜變化情況

圖2 各組 1 001/cm與 1 337/cm峰峰面積比較

3 討論

拉曼光譜信息從入射光與樣品分子對(duì)入射光振動(dòng)頻率的差別中得到，光譜的振動(dòng)頻率是原子團(tuán)和化學(xué)鍵的特性[2]，因此分析拉曼光譜可以獲得相應(yīng)原子團(tuán)與化學(xué)鍵的構(gòu)象及含量的相關(guān)信息，現(xiàn)已成為物理、生物醫(yī)學(xué)等跨學(xué)科領(lǐng)域研究和檢測(cè)的重要方法[3，4]。拉曼譜線強(qiáng)度正比于散射中心的數(shù)目，亦即光譜峰面積的大小正比于其指認(rèn)物質(zhì)含量的多少[5，6]。1 001/cm與 1 337/cm峰峰面積分別代表蛋白質(zhì)及核苷酸的含量[2]。本研究 1 001/cm與1 337/cm峰峰面積總體上隨著凋亡率的增加而降低，表明細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及 DNA的含量隨著凋亡率的增加而不斷降低，與 Notingher等[1]研究一致，也與目前對(duì)凋亡的認(rèn)識(shí)是一致的。

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)半胱氨酸蛋白酶家族的成員被水解激活，活化的酶又可以催化其他底物蛋白的水解，凋亡細(xì)胞膜通透性增高，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)可以從細(xì)胞膜漏出，造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的降低。細(xì)胞凋亡時(shí)，內(nèi)源性的核酸內(nèi)切酶被激活，在核小體的連接處將 DNA切斷為 200 bp整數(shù)倍的小片段，凋亡晚期 DNA降解加劇，并且細(xì)胞膜通透性更高，降解的核酸就通過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散到細(xì)胞外，因此核酸堿基的含量也會(huì)下降。至于具體哪些蛋白質(zhì)、DNA發(fā)生上述變化，還需要借助其他分子生物學(xué)手段進(jìn)一步分析確認(rèn)。高糖誘導(dǎo) β細(xì)胞凋亡，促凋亡蛋白如 Bax、Bim、Puma、TXNIP、p53等表達(dá)會(huì)增加[7，8]，同時(shí)凋亡的細(xì)胞因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的水解使蛋白質(zhì)含量下降;高糖還可以刺激 β細(xì)胞分泌胰島素。凋亡細(xì)胞內(nèi)除有DNA降解斷裂外還有促凋亡蛋白基因合成，同時(shí)高糖刺激胰島素合成分泌，胰島素基因的合成也會(huì)增加。高糖培養(yǎng)第 2天與相應(yīng)的正常對(duì)照組及處理前組 1 001/cm峰峰面積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高糖培養(yǎng)第 2天與相應(yīng)的對(duì)照組 1 337/cm峰峰面積也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但凋亡率卻有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究測(cè)定的樣本包括正常與凋亡細(xì)胞，考慮由上述原因造成蛋白質(zhì)及 DNA減少與增加的量相平衡時(shí)差別就不能顯現(xiàn)出來(lái)。處理前與正常糖濃度培養(yǎng)第 2天及第 4天的凋亡率差異并不大，但 1 337/cm峰面積有差異，考慮與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞內(nèi) DNA的含量較其他生長(zhǎng)階段多及拉曼光譜靈敏度高有關(guān)。本研究高糖除可以誘導(dǎo)胰島 β細(xì)胞凋亡外，短期的高糖還會(huì)刺激其分泌胰島素，使得光譜的變化復(fù)雜化，若想觀察凋亡β細(xì)胞光譜動(dòng)態(tài)的變化，也許使用對(duì)細(xì)胞僅有致凋亡作用的藥物來(lái)研究或?qū)ν患?xì)胞從凋亡開(kāi)始到凋亡結(jié)束整個(gè)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)會(huì)好一些。

三磷酸腺苷(ATP)由腺嘌呤和三個(gè)磷酸分子組成，Szkudelshi等[9]認(rèn)為鏈脲佐菌素是通過(guò)耗竭細(xì)胞內(nèi) ATP，使大量反應(yīng)性氧簇產(chǎn)生從而對(duì) β細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。梁燕玲等[10]發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞內(nèi) ATP的含量較正常細(xì)胞低，且凋亡率越高其含量越低。Faradji等[11]發(fā)現(xiàn)重組腺病毒轉(zhuǎn)染后高表達(dá) GLUT2/GK的 β細(xì)胞凋亡率隨著葡萄糖濃度的增加而增加，同時(shí)伴隨著 ATP的減少。本研究代表細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤含量的 1 337/cm峰峰面積隨著凋亡率的增加而降低，推測(cè)高糖有可能通過(guò)干擾細(xì)胞內(nèi)的腺嘌呤核苷酸代謝而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腺嘌呤參與 ATP的組成，那么改善胰島 β細(xì)胞能量代謝，細(xì)胞的凋亡能否得到改善有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，激光光鑷?yán)庾V系統(tǒng)能反映凋亡細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與核苷酸含量的變化，高糖有可能通過(guò)干擾細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核苷酸代謝來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)中拉曼光譜的變化具體由何種蛋白質(zhì)或核苷酸所貢獻(xiàn)，仍需要進(jìn)一步研究。拉曼光譜能提供生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)變化的豐富信息，有可能成為一種新的研究凋亡細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)和含量改變的有效手段。

[1]Notingher I，Verrier S，Haque S，et al.Spectroscopic study of human lung epithelial cells(A549)in culture:living cellsversus dead cells[J].Biopolymers，2003，72(4):230-240.

[2]許以明.激光拉曼光譜儀[M].北京:科學(xué)出版社，1987:69-85.

[3]Bird B，Miljkovic M，Romeo MJ，et al.Infrared micro-spectral imaging:distinction of tissue types in axillary lymph node histology[J].BMCClin Pathol，2008，8:8.

[4]Matthaus C，Chernenko T，Newmark JA，et al.Label-freedetection of mitochondrial distribution in cells by nonresonant Raman microspectroscopy[J].Biophys J，2007，93(2):668-673.

[5]Brunner H，Sussner H.Raman scattering of native and thermally denatured lysozyme[J].Biochim Biophys Acta，1972，271(1):16-22.

[6]Xu YM，Zhang ZY，Zhao KJ，et al.Molecular mechanism of high energy proton radiation-Raman spectroscopic character of mirocosmic damage in the space structure of DNA[J].Sci China B，1993，36(11):1325-1332.

[7]Mckenzie MD，Jamieson E，Jansen ES，et al.Glucose induces pancreatic islet cell apoptosis that requires the BH3-only proteins bim and puma and Multi-BH domain protein bax[J].Diabetes，2010，59(3):644-652.

[8]Chen J，Saxena G，Mangrue IN，etal.Thioredoxin-interacting protein a critical link between glucose toxicity and beta-cell apoptosis[J].Diabetes，2008，57(4):938-944.

[9]Szkudelshi T.The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas[J].Physiol Res，2001，50(6):537-546.

[10]梁燕玲，張?zhí)K明，許康，等.短暫腦缺血再灌流后 ATP含量變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].腦與神經(jīng)疾病雜志，2005，13(2):120-122.

[11]Faradji RN，Havari E，Chen Q，et al.Glucose-induced toxicity in insulin-producing pituitary cellsthat coexpress GLUT2 and glucokinase[J].JBiol Chem，2001，276(39):36695-36702.