毛金媛 ，李英慧 ，單忠艷 ，滕衛(wèi)平 ，趙彥艷*

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué))

瘦素(LEP)是由 LEP基因編碼的、167個(gè)氨基酸組成的多肽激素，通過(guò)與其受體的結(jié)合，活化細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在生物體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)功能[1]。人類(lèi) LEP(hLEP)基因定位于染色體7q31.3，全長(zhǎng)約 16 kD，含有 3個(gè)外顯子和 2個(gè)內(nèi)含子，其中包含有 3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)。研究表明，3′-UTR參與了 mRNA的穩(wěn)定性、基因表達(dá)的定位以及翻譯效率等生理進(jìn)程的調(diào)控。微小 RNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度 19～25 nt的單鏈非編碼 RNA分子，能與靶基因 mRNA的 3′-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)[2]。2009～2010年，我們觀察了hLEP基因 3′-UTR對(duì)基因表達(dá)的影響，尤其是 miRNA對(duì) hLEP基因的調(diào)控作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒 pGL3-Promoter、pRL-TK購(gòu)自美國(guó)Promega公司，miR-296的表達(dá)載體 pre-miRTMhsamir-296 miRNA Precursor(簡(jiǎn)寫(xiě)為 pmiR-296)及 Negative Control(簡(jiǎn)寫(xiě)為 pmiR-NC)購(gòu)自美國(guó) Ambion公司。T4 DNA連接酶、各種限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自美國(guó) NEB公司。感受態(tài)大腸桿菌 JM109細(xì)胞購(gòu)自日本 Takara公司。胰蛋白胨、酵母提取物及瓊脂粉購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich公司，DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自德國(guó) Qiagen公司。細(xì)胞轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000為美國(guó) Invitrogen公司產(chǎn)品。雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó) Promega公司。人肝癌 Hep G2細(xì)胞株為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌 Hep G2細(xì)胞常規(guī)在DMEM培養(yǎng)基(含 10%的胎牛血清，100 U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)、37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng) 24～48 h，0.25%的胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 miRNA的生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 利用 miRanda、TargetScan和 PicTar生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè) hLEP基因(Gene ID:3952)3′-UTR潛在的 miRNA結(jié)合位點(diǎn)。站點(diǎn)如下:http://www.microma.org;http://genes.mit.edu/targetscan;http://pictar.bio.nyu.edu。

1.2.3 pGL3-LEP載體的構(gòu)建 以人 cDNA文庫(kù)為模板，通過(guò) PCR方法擴(kuò)增 hLEP的 3′-UTR片段，上游 引 物:5′-GCTCTAGAGTGCCAAGGTGGGGTATTTA-3′， 下 游 引 物:5′-TGTCTAGAATCTTGTTTCAAAGGGATGTGG-3′，在引物兩端引入 XbaI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 210 bp。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物于 l%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察 PCR結(jié)果。按 Qiagen說(shuō)明書(shū)純化 PCR產(chǎn)物，將 PCR擴(kuò)增片段酶切純化后克隆至 pGL3-Promoter熒光素酶編碼基因下游XbaI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒，由 Invitrogen公司測(cè)序、確認(rèn)并鑒定序列插入的正反向，正向插入的命名為pGL3-LEP。

1.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性檢測(cè) 利用脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000在 24孔板內(nèi)將熒光素酶報(bào)告載體與 miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至 HepG2細(xì)胞中，具體方法參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染 24 h后，采用Dual-gloTM雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以±s表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hLEP基因 3′-UTR上 miRNA結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用生物信息學(xué)在線軟件，在 hLEP基因 3′-UTR第 1 821位預(yù)測(cè)到有 1個(gè) miR-296的結(jié)合位點(diǎn)，mi-Randa評(píng)分為 171，結(jié)合能量為 -30.8 kCal/mol。

2.2 構(gòu)建含有 hLEP基因 3′-UTR的熒光素酶報(bào)告載體 為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)信息的準(zhǔn)確性，通過(guò)基因重組在 pGL3-Promoter載體(引自 Promega公司《Technical Manual—pGL3 Luciferase Reporter Vectors》)熒光素酶編碼基因下游 XbaI酶切位點(diǎn)插入 hLEP 3′-UTR片段，使其包含有 miR-296的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告基因載體 pGL3-LEP。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定大小正確，并進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。

圖1 A:p GL3-LEP的結(jié)構(gòu)示意圖;B:hLEP 3′-UTR片段PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果 將 pGL3-LEP、pmiR-296或其各自的對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 HepG2細(xì)胞 24 h后發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組比較，pmiR-296可使 pGL3-LEP的熒光素酶活性下降 50%(P＜0.05)，而對(duì)不含有 hLEP基因 3′-UTR的對(duì)照質(zhì)粒 pGL3-Promoter，pmiR-296不影響熒光素酶的表達(dá)，說(shuō)明 miR-296與hLEP基因 3′-UTR存在靶向作用關(guān)系，驗(yàn)證了預(yù)測(cè)信息的準(zhǔn)確性。見(jiàn)圖2。

圖2 熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

同時(shí)還觀察到，在單獨(dú)轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告載體時(shí)，即不共轉(zhuǎn)染 pmiR-296或陰性對(duì)照組的情況下，pGL3-LEP的熒光素酶活性顯著高于 pGL3-Promoter(P＜0.05)，前者是后者的 1.7倍，提示這段序列可能具有增強(qiáng)子作用。

3 討論

LEP主要是由脂肪細(xì)胞分泌的一類(lèi)肽類(lèi)激素。LEP基因主要在白色脂肪組織中表達(dá)，在棕色脂肪組織中表達(dá)較少。其主要功能是調(diào)節(jié)能量平衡，維持正常體質(zhì)量。研究表明，LEP與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)，而肥胖又是高血壓、高血脂、糖尿病、非酒精性脂肪肝以及腫瘤等疾病發(fā)生的重要因素。許多研究顯示，在上述疾病中血清 LEP水平顯著異常[3，4]。本研究預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了 miR-296可與 hLEP基因 3′-UTR的特定區(qū)域結(jié)合，抑制基因的表達(dá)，同時(shí) hLEP基因 3′-UTR還具有增強(qiáng)子的作用，這表明 LEP的表達(dá)受多方面調(diào)控，hLEP基因 3′-UTR在不同水平發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，彼此可能存在相互制約平衡。

hLEP基因 3′-UTR是真核生物 mRNA的重要功能元件，在基因的表達(dá)調(diào)控、mRNA定位等方面起著重要作用[5]。調(diào)控阻遏物與處于 3′-UTR內(nèi)的順式作用元件結(jié)合，可使 mRNA在不同時(shí)間得以表達(dá)。真核生物 mRNA 3′-UTR大多含有特定的負(fù)調(diào)控元件，能與反式作用因子相互作用抑制翻譯的進(jìn)行[6]，尤其是 miRNA，能通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)來(lái)參與生命過(guò)程中的許多重要進(jìn)程。通過(guò)與生物信息學(xué)跨種屬的序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，涉及 3′-UTR的調(diào)控元件中接近一半與miRNA有關(guān)，人類(lèi)30%的基因可能受miRNA的調(diào)控[7]。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到 hLEP基因3′-UTR中存在 miR-296的潛在結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)過(guò)表達(dá) miR-296觀察到含有 hLEP基因3′-UTR的報(bào)告基因表達(dá)被抑制，說(shuō)明 hLEP是 miR-296的靶基因。生物信息學(xué)研究顯示，一個(gè) miRNA可以調(diào)控約 200個(gè)基因，因此 miR-296可能存在多個(gè)靶基因，本研究即證實(shí)了 miR-296一個(gè)新的靶基因。

本研究還發(fā)現(xiàn)，hLEP基因 3′-UTR可以增強(qiáng)基因的表達(dá)，有增強(qiáng)子的作用，與 Palmer等[8]報(bào)道Snail基因 3′端含有增強(qiáng)子類(lèi)似。這種增強(qiáng)子發(fā)揮作用的方式可能有兩種:①3′-UTR也存在類(lèi)似 5′端序列的順式反應(yīng)元件，通過(guò)與反式因子結(jié)合調(diào)控基因表達(dá);②可能是通過(guò)遠(yuǎn)隔交互作用與基因的 5′端發(fā)生聯(lián)系從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

肥胖正在成為全球日益嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題，LEP的異常表達(dá)不但與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)，而且與肥胖相關(guān)的各種代謝性疾病密不可分，因此調(diào)控LEP的表達(dá)對(duì)于這些疾病的防治具有重要意義。

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