金 實(shí)，劉 聰，任劍明，紀(jì)紅梅，任 蕾

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032;2中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院;3東北制藥集團(tuán);4鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，作為促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的載體，其表達(dá)及功能改變可能與骨骼肌、脂肪組織的胰島素抵抗密切相關(guān)。2010年5月，我們對(duì)GLUT4 mRNA在糖尿病大鼠骨骼肌及脂肪組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了觀察，旨在進(jìn)一步探索2型糖尿病發(fā)病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠46只，體質(zhì)量180～220 g(中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部);鏈脲佐菌素(STZ)，RNA 提取液，DL2000DNA Marker，GLUT4及β-actin上下游引物;胰島素放射免疫試劑盒，RT-PCR試劑盒。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將46只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及高脂組各10只、高血糖組及糖尿病組各13只，各組均自由攝食(常規(guī)飼料)、飲水，12 h光照周期，室溫保持18～28℃，1周后禁食12 h，斷尾取血測空腹血糖。其后高脂組和糖尿病組飼喂高脂飲食(于常規(guī)飼料中分別以30%、10%、3%加入豬油、白砂糖、雞蛋黃，蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物所占比例分別為9.3%、59.1%、31.6%)，對(duì)照組和高血糖組則繼續(xù)飼喂常規(guī)飼料，其中高血糖組同時(shí)于腹腔內(nèi)注射STZ 55mg/kg、其余三組腹腔內(nèi)注射等量檸檬酸緩沖液，72 h后高血糖組斷尾取血，測血糖＞16.7 mmol/L、尿糖3+～4+持續(xù)3 d視為高血糖造模成功。其后各組同前飼養(yǎng)，6周后各組禁食12 h、稱體質(zhì)量，糖尿病組腹腔內(nèi)注射STZ 30mg/kg，其余三組腹腔內(nèi)注射等量檸檬酸緩沖液，72 h后糖尿病組斷尾、取血，測血糖及尿糖達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)視為2型糖尿病造模成功［1］。各組均繼續(xù)飼養(yǎng)4周至第10周結(jié)束實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中糖尿病組造模失敗2只、死亡1只，高血糖組造模全部成功、死亡4只。

1.3 空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)等檢測上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，四組均禁食12 h、測體質(zhì)量，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，并進(jìn)行心臟采血，采用拜安捷快速血糖儀檢測FBG，用放射免疫法檢測FINS，按公式ln［1/(FPG×FINS)］計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI);采血結(jié)束后斷椎處死動(dòng)物，快速取大鼠右后肢大腿肌肉組織，附睪周圍脂肪及腎周脂肪，稱脂肪質(zhì)量后立即將標(biāo)本置于液氮中，于-80℃保存。

1.4 骨骼肌及脂肪組織中GLUT4 mRNA表達(dá)測定①引物設(shè)計(jì):GLUT4引物擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為154 bp，內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為690 bp。②RNA提取及反轉(zhuǎn)錄:取骨骼肌組織、脂肪組織各100mg，應(yīng)用RNA提取液提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系12 μl，條件為65 ℃1min，30 ℃5min，15～30min勻速升溫至65℃，65℃30min，98℃5min，5 ℃5min。③PCR 反應(yīng):反應(yīng)體系25 μl，包括cDNA 3 μl、滅菌蒸餾水17.1 μl，10 × Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture 2 μl、Bca-Optimized Taq 0.2 μl、GLUT4或β-actin上下游各0.1 μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min，94℃變性40 s(β-actin為30 s)，55.9 ℃退火1min，72 ℃延伸1min(β-actin為5min)，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。72℃延伸7min。④反應(yīng)產(chǎn)物檢測與分析:PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，取PCR產(chǎn)物5 μl電泳30min，將凝膠放入G:Box Sygene PCR分析儀中拍照記錄結(jié)果，用激光密度掃描儀記錄GLUT4和β-actin電泳帶密度進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析，組間比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 FBG、FINS及 ISI 10周后四組FBG、FINS及ISI見表1。

表1 四組FBG、FINS及 ISI比較(±s)

表1 四組FBG、FINS及 ISI比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01

ISI糖尿病組 10 9.39±1.86* 17.16±1.95* -5.08±0.12組別 n FBG(mmol/L) FINS(IU/L)*高脂組 10 5.95±0.81 24.92±1.13* -4.99±0.17*高血糖組 9 24.01±6.49* 3.01±1.34 -4.13±0.44照組10 5.02±0.67 7.66±0.75 -3.64±0.22對(duì)

2.2 骨骼肌和脂肪組織中GLUT4 mRNA表達(dá) 10周后四組骨骼肌和脂肪組織中GLUT4 mRNA表達(dá)見表2。

表2 四組GLUT4 mRNA表達(dá)比較(±s)

表2 四組GLUT4 mRNA表達(dá)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與脂肪組織比較，△P＜0.01

骨骼肌 脂肪糖尿病組 10 1.62±0.33＊△0.84±0.14組別 n*1.40±0.24高脂組 10 1.70±0.25＊△0.93±0.21*高血糖組 9 1.40±0.49＊△0.71±0.15*對(duì)照組 10 2.61±0.60△

3 討論

葡萄糖是機(jī)體能量的主要來源，而GLUT4為最主要的葡萄糖運(yùn)載體［2］，存在于胰島素敏感的骨骼肌、心肌、脂肪等細(xì)胞中。無胰島素刺激時(shí)GLUT4主要位于細(xì)胞儲(chǔ)存囊泡內(nèi);胰島素與受體結(jié)合后，可通過多種蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用［3］調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)，此使胰島素敏感組織可迅速對(duì)循環(huán)胰島素水平作出反應(yīng)、保持血糖平衡［4，5］，而GLUT4合成、分泌以及轉(zhuǎn)位等異常均可能導(dǎo)致2型糖尿病。胰島素抵抗是2型糖尿病重要發(fā)病機(jī)制之一。Carvalho等發(fā)現(xiàn)，在dB/dB小鼠模型中，過量表達(dá)GLUT4可改善糖尿病病情，而GLUT4遺傳缺陷者則表現(xiàn)為胰島素抵抗。目前研究認(rèn)為，胰島素抵抗與組織中GLUT4內(nèi)在活性降低、再分布(特別是胰島素刺激后細(xì)胞內(nèi)膜向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位減少)、基因轉(zhuǎn)錄受抑導(dǎo)致GLUT4 mRNA和蛋白含量減少有關(guān)［4］。

本研究顯示，與對(duì)照組比較糖尿病組 FBG、FINS及ISI顯著升高、骨骼肌及脂肪組織中GLUT4 mRNA表達(dá)均明顯下調(diào);高血糖組、高脂組骨骼肌和脂肪組織GLUT4 mRNA表達(dá)亦顯著低于對(duì)照組。進(jìn)一步證實(shí)GLUT4 mRNA表達(dá)下降所致骨骼肌、脂肪組織對(duì)葡萄糖攝取利用減少是胰島素抵抗的重要分子基礎(chǔ)，是誘發(fā)2型糖尿病的原因之一;高脂和高血糖可能均為引起GLUT4 mRNA表達(dá)改變的主要因素。本研究還顯示，GLUT4 mRNA在骨骼肌中的表達(dá)顯著高于脂肪組織，與以往研究基本一致。文獻(xiàn)報(bào)道，高脂飲食可下調(diào)白色脂肪組織中GLUT4水平，并明顯減弱有胰島素刺激脂肪細(xì)胞的GLUT4轉(zhuǎn)位及葡萄糖攝取，此作用隨飲食中n-3多不飽和脂肪酸的增加而減弱;脂肪細(xì)胞GLUT4表達(dá)水平下降還可誘導(dǎo)肌肉、肝臟等組織的胰島素抵抗［6］;高血糖、高胰島素血癥可引起GLUT4基因轉(zhuǎn)錄功能障礙、GLUT4蛋白合成減少，導(dǎo)致肌細(xì)胞攝取和利用葡萄糖的能力下降［7］。

綜上所述，GLUT4 mRNA在骨骼肌中的表達(dá)高于脂肪組織;高脂、高血糖可通過下調(diào)GLUT4 mRNA表達(dá)加重胰島素抵抗，進(jìn)而誘發(fā)2型糖尿病。

［1］司曉晨，尚文賓，卞慧敏，等.鏈脲佐菌素加高脂飲食誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型［J］.安徽中醫(yī)臨床雜志，2003，15(5):383-385.

［2］遲鋮，金苗苗，母義明，等.糖尿病大鼠模型建立及其脂肪組織PPARγ和GLUT4表達(dá)的改變［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(3):220-222.

［3］James DE.MUNC-ing around with insulin action［J］.J Clin invest，2005，155(2):219-221.

［4］Watson RT，Pessin J.Intracellular organization of insulin signaling and GLUT4 translocation［J］.Recent Prog Horm Res，2001，56(2):175-193.

［5］Mohammad A，Sharma V，Mcneill JH.Vanadium increases GLUT4 in diabetic rat skeletal muscle［J］.Mol Cell Biochem，2002，233(1):139-143.

［6］Abel ED，Peroni O，Kim JK，et al.Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver［J］.Nature，2001，409(6821):729-733.

［7］Chan P，Wong KL，Lin IM，et al.Antihyperglycemic action of angiotensin Ⅱ receptor antagonist valsartan，in streptozot-ocin-induced diabetic rats［J］.Hypertension，2003，21(4):761-769.