肖 莉，李鳳春，李振華

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽(yáng)110004;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

目前研究認(rèn)為，三氧化二砷(As2O3)除能誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡外［1］，亦能抑制多種細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡［2］。目前肺纖維化治療較為棘手，而IL-13為調(diào)控其病理過(guò)程的主要Th2細(xì)胞因子，其抑制劑能減輕Th2主導(dǎo)炎癥反應(yīng)所致肺組織纖維化程度［3］。2006年12月，我們觀(guān)察了As2O3對(duì)IL-13促肺成纖維細(xì)胞增殖及炎性介質(zhì)分泌的影響，旨在進(jìn)一步研究As2O3的抗肺纖維化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺 成纖維NIH3T3細(xì)胞株;0.1%As2O3注射液，重組白細(xì)胞介素(rIL)-13;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，由PBS稀釋成12 mmol/L后過(guò)濾除菌，4℃避光保存;兔抗小鼠巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-1α多克隆抗體及原位雜交試劑盒，IL-6、IL-8放射免疫檢測(cè)試劑盒。

1.2 細(xì)胞處理及增殖抑制率(IR)檢測(cè) 將NIH3T3細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS、無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下培養(yǎng)。將傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且0.2%臺(tái)盼藍(lán)拒染率＞95%的細(xì)胞隨機(jī)分為觀(guān)察1組、觀(guān)察2組及對(duì)照組，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，按每孔200 μl加入96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，觀(guān)察1組、觀(guān)察2組均加入80 ng/ml rIL-13，此外觀(guān)察1組及觀(guān)察2組分別加入2、4 μmol/L的As2O3溶液各200 μl，對(duì)照組加入DMEM，三組均培養(yǎng)24 h和48 h。三組每孔中加入MTT 15 μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，于490 nm處測(cè)定吸光度值(每組均重復(fù)作5孔)。IR(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值)×100%。

1.3 細(xì)胞處理及 MIP-1α mRNA表達(dá)測(cè)定 取NIH3T3細(xì)胞以2×105/ml種植于培養(yǎng)瓶和內(nèi)裝有蓋玻片的6孔板中，24 h細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液同上分組及處理，同時(shí)設(shè)僅加入rIL-13者為觀(guān)察3組，各組均培養(yǎng)24 h(每時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔)。采用原位雜交法測(cè)定MIP-1α mRNA表達(dá):將培養(yǎng)于蓋玻片的各組細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定20min，加胃蛋白酶于37℃消化60 s，37℃加預(yù)雜交液4 h，37℃雜交過(guò)夜;洗片，封閉液37℃封閉30min，分別滴加生物素化鼠抗地高辛、鏈霉親和素—生物素—酶復(fù)合物(SABC)、生物素化過(guò)氧化物酶，PBS洗滌;DAB顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明封片。陰性對(duì)照用預(yù)雜交液替代探針工作液。采用Metamorph/DP10/型細(xì)胞圖像分析儀進(jìn)行 MIP-1α mRNA半定量分析(光密度值)，其中表達(dá)陽(yáng)性指細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒呈棕褐色點(diǎn)狀或條狀分布。

1.4 細(xì)胞IL-6、IL-8水平測(cè)定 收集1.3各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用IL-6、IL-8放射免疫試劑盒檢測(cè)IL-6、IL-8水平，具體步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間比較用方差分析。P≤0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 IR As2O3處理后觀(guān)察1組、觀(guān)察2組細(xì)胞增殖明顯受抑，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 As2 O3處理后24、48 h觀(guān)察1組和觀(guān)察2組IR 比較(n=5，%，±s)

表1 As2 O3處理后24、48 h觀(guān)察1組和觀(guān)察2組IR 比較(n=5，%，±s)

注:與觀(guān)察1組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.01;與同組24 h比較，△P＜0.05

24 h 48 h觀(guān)察1組 30.13±5.60 53.14±8.25組別△觀(guān)察2組 55.14±9.03* 71.05±10.62＊△

2.2 MIP-1α mRNA表達(dá) 觀(guān)察1組為15.23±3.16、觀(guān)察2組為10.22±3.56、觀(guān)察3組為40.15±3.66、對(duì)照組為25.83±2.35，觀(guān)察3組 MIP-1α mRNA表達(dá)顯著強(qiáng)于其他三組，且觀(guān)察2組強(qiáng)于觀(guān)察1組(P均＜0.05)。

2.3 IL-6、IL-8水平 見(jiàn)表2。

3 討論

表2 各組 IL-6、IL-8 水平(n=6，±s)

表2 各組 IL-6、IL-8 水平(n=6，±s)

注:與其他三組比較，*P＜0.01;與對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別 IL-6(pg/ml) IL-8(ng/ml)觀(guān)察1組 109.22±20.14△0.26±0.08△觀(guān)察2組 92.64±21.66△0.25±0.11△觀(guān)察3組 548.66±71.76*0.51±0.07*對(duì)照組143.36±25.870.31±0.06

研究顯示，成纖維細(xì)胞是肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中真正的效應(yīng)細(xì)胞［4］，其不僅可分泌膠原促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，還可分泌炎性介質(zhì)，對(duì)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的活化和聚集有促進(jìn)作用。我們前期的研究表明，成纖維細(xì)胞表面有IL-13受體，IL-13能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、分泌炎性介質(zhì)和增強(qiáng)Ⅰ型膠原表達(dá)［5］。As2O3是傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，是目前腫瘤患者化療最有效的藥物之一，其作用機(jī)制主要包括刺激分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖和抑制血管生成［6］。Han 等［7］發(fā)現(xiàn) As2O3對(duì)子宮頸癌Hela細(xì)胞、牛肺動(dòng)脈上皮細(xì)胞、人肺成纖維細(xì)胞等亦具有上述作用;我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，As2O3可抑制NIH3T3成纖維細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間—濃度依賴(lài)效應(yīng);As2O3可使細(xì)胞周期G0/G1期比例增加，G2/M期減少，即將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。本研究顯示，As2O3處理后觀(guān)察1組、觀(guān)察2組細(xì)胞增殖明顯受抑，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。進(jìn)一步證實(shí)As2O3可能對(duì)肺纖維化的發(fā)展有阻滯作用，但具體機(jī)制有待于深入研究。

目前認(rèn)為，肺纖維化是Th2型細(xì)胞因子調(diào)控炎癥反應(yīng)的結(jié)果，細(xì)胞因子平衡向Th2方向轉(zhuǎn)化時(shí)即可導(dǎo)致肺纖維化，故細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。IL-6是Th2細(xì)胞因子，正常情況下可由淋巴類(lèi)或非淋巴類(lèi)(如T細(xì)胞、B細(xì)胞及成纖維細(xì)胞)分泌，具有較強(qiáng)的促平滑肌細(xì)胞增殖作用。IL-8是中性粒細(xì)胞趨化因子，在肺部主要由肺泡巨噬細(xì)胞分泌。研究證實(shí)，肺成纖維細(xì)胞亦能分泌IL-8［8］;特發(fā)性肺纖維化患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增高，IL-8可能通過(guò)趨化作用募集更多的中性粒細(xì)胞而發(fā)揮致肺纖維化作用，rIL-13可促進(jìn)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分泌IL-6和IL-8;As2O3能降低博來(lái)霉素致肺纖維化大鼠BALF中中性粒細(xì)胞百分比及肺組織羥脯氨酸含量。本研究顯示，觀(guān)察3組IL-6、IL-8水平顯著高于其他三組。提示成纖維細(xì)胞參與了炎癥反應(yīng)過(guò)程，As2O3可通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子失衡和抑制中性粒細(xì)胞聚集發(fā)揮抗肺纖維化作用。MIP-1α屬C-C型趨化因子，可由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞分泌，是引導(dǎo)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞定向趨化的重要因子。多數(shù)肺纖維化在機(jī)體損傷后(損傷、炎癥和修復(fù))一個(gè)或更多階段存在失衡［9］，其中MIP-1α等趨化因子在肺炎和肺纖維化過(guò)程中起重要作用。Standiford等研究表明，特發(fā)性肺纖維化患者BALF中MIP-1α水平顯著高于對(duì)照組，且其BALF對(duì)單核細(xì)胞的趨化活性比對(duì)照組增高1.8倍;特發(fā)性肺纖維化患者肺組織中成纖維細(xì)胞MIP-1α表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。本研究顯示，As2O3可抑制rIL-13促成纖維細(xì)胞內(nèi)MIP-1α表達(dá)的作用，且呈劑量—效應(yīng)關(guān)系。表明As2O3可能通過(guò)抑制Th2細(xì)胞因子所致趨化作用而在抑制炎癥反應(yīng)和抑制成纖維細(xì)胞增殖等多方面發(fā)揮抗肺纖維化作用。

總之，As2O3可能通過(guò)抑制rIL-13誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖及炎性介質(zhì)表達(dá)而發(fā)揮抗肺纖維化作用。

［1］Binet F，Antoine F，Girard D.Interaction between arsenic trioxide and human primary cells:emphasis on human cells of myeloid origin［J］.Inflamm Allergy Drug Targets，2009，8(1):21-27.

［2］Padovani AM，Molina MF，Mann KK.Inhibition of liver x receptor/retinoid X receptor-mediated transcription contributes to the proatherogenic effects of arsenic in macrophages in vitro［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30(6):1228-1236.

［3］Wynn TA.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis［J］.Pathol，2008，214(2):199-210.

［4］Kunkel SL，Chensue SW，Lukacs N，et al.Cytokine phenotypes serve as a paradigm for experimental immune-mediated lung diseases and remodeling［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2003，29(Suppl):S63-S66.

［5］肖莉，熬然，李振華，等.重組白細(xì)胞介素13促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成［J］.中國(guó)病理生理雜志，2005，21(8):1579-1583.

［6］Wu YC，Yen WY，Yih LH.Requirement of a functional spindle checkpoint for arsenite-induced apoptosis［J］.J Cell Biochem，2008，105(3):678-687.

［7］Han YH，Moon HJ，You BR，et al.Effects of arsenic trioxide on cell，reactive oxygen species and glutathione levels in different cell types［J］.Int J Med，2010，25(1):121-128.

［8］Wangoo A，Sparer T，Brown IN，et al.Contribution of Th1 and Th2 cells to protection and pathology in experimental models of granulomatous lung disease［J］.J Immunmol，2001，166(5):3432-3439.

［9］Wilson MS，Wynn TA.Pulmonary fibrosis:pathogenesis，etiology and regulation［J］.Mucosal Immunol，2009，2(2):103-121.