李燕，趙春才，劉艷艷（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院，南京市 10008；.南京安格醫(yī)藥化工有限公司，南京市 10009）

維格列汀[1]是Ⅳ型二肽基肽酶（DPP-4）抑制劑，通過與DPP-4結(jié)合形成DPP-4復(fù)合物而抑制該酶的活性，在提高胰高血糖素樣多肽（GLP）-1濃度、促使胰島B細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的同時(shí)，可降低胰高血糖素濃度，從而降低血糖，且對(duì)體重?zé)o明顯影響。維格列汀片由諾華公司研發(fā)，2007年9月由歐盟委員會(huì)批準(zhǔn)上市，商品名為Galvus。維格列汀片的含量及有關(guān)物質(zhì)測(cè)定目前未見有文獻(xiàn)報(bào)道，為此，本文建立了高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定其主藥和有關(guān)物質(zhì)含量，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HPLC儀，包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外檢測(cè)器、UV-2401PC紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）。

1.2 試藥

維格列汀片（南京安格醫(yī)藥化工有限公司制劑室，批號(hào)：100316、100317、100318，規(guī)格：每片50 mg）；維格列汀對(duì)照品（南京安格醫(yī)藥化工有限公司合成室，由批號(hào)為100302的原料藥精制而成，含量：99.64%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.01 mol·L－1磷酸氫二鉀溶液-乙腈（75∶25）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品與對(duì)照品溶液：取樣品片劑研成的粉末適量，約相當(dāng)于維格列汀25 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，過濾；取續(xù)濾液5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另取維格列汀對(duì)照品，同法用流動(dòng)相溶解并制成每1 mL中含125 μg的溶液作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 有關(guān)物質(zhì)溶液：取樣品片劑研成的粉末（輔料不干擾測(cè)定）適量，用流動(dòng)相制成維格列汀濃度為0.25 mg·mL－1的溶液作為供試液；取該液適量，用流動(dòng)相稀釋制成2.5 μg·mL－1的溶液作為對(duì)照液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品、供試品溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并以空白輔料的流動(dòng)相溶液作為陰性對(duì)照，進(jìn)樣分析。結(jié)果，在上述色譜條件下，維格列汀的理論板數(shù)為7293，保留時(shí)間為7.535 min，峰形對(duì)稱，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.陰性對(duì)照；B.對(duì)照品；C.供試品；1.維格列汀Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank excipients；B.reference substance；C.test sample；1.vildagliptin

2.4 線性關(guān)系與定量限考察

取維格列汀對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解并稀釋成濃度分別為225.0、175.0、125.0、75.0、25.0 μg·mL－1的溶液，分別精密量取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜。以進(jìn)樣濃度（c）為橫坐標(biāo)，維格列汀的峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝2.1654×104+3.5916×104c（r＝0.9999，n＝5）。表明維格列汀檢測(cè)濃度的線性范圍為25.0～225.0 μg·mL－1。以信噪比S/N＝10計(jì)算，得維格列汀定量限為8 ng。

2.5 精密度試驗(yàn)

取維格列汀對(duì)照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，峰面積值的RSD＝0.21%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同批樣品6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品和對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣20 μL；在上述色譜條件下，分別測(cè)定每份樣品的含量。結(jié)果平均含量為99.46%，RSD＝0.38%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液1份，在0、1、2、4、6 h分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定，以峰面積計(jì)算RSD為0.19%，結(jié)果表明，供試品溶液在6 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)

取同批樣品，按測(cè)試濃度的80%、100%、120%3個(gè)濃度分別加入維格列汀對(duì)照品，每個(gè)濃度3份，照“2.9”項(xiàng)下“（1）”項(xiàng)方法操作，計(jì)算回收率，結(jié)果詳見表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

（1）主藥含量：取維格列汀片研成的粉末及對(duì)照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法分別制備成供試品、對(duì)照品溶液。分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，并按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果詳見表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 樣品中主藥及有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Content determination of vildagliptin and the related substances in samples

（2）有關(guān)物質(zhì)含量：取維格列汀片研成的粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試液和對(duì)照液。量取對(duì)照液20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器檢測(cè)靈敏度，使維格列汀峰峰高為滿量程的10%～30%；再量取供試液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜至主峰保留時(shí)間的3倍，記錄主峰和有關(guān)物質(zhì)的峰面積，按1%自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量，結(jié)果詳見表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取維格列汀對(duì)照品及片劑研成的粉末適量，分別用流動(dòng)相制備成濃度約20 μg·mL－1的對(duì)照品、供試品溶液，按紫外分光光度法[2]操作，于190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，對(duì)照品、供試品溶液均于210、265 nm波長(zhǎng)左右有最大吸收，但265 nm波長(zhǎng)處響應(yīng)值只有0.102，且前一步中間體在此波長(zhǎng)下僅有末端吸收；而輔料溶液在210 nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)選為210 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇

通過對(duì)維格列汀及其各步中間體及破壞后樣品的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)采用濃度為0.01 mol·L－1的磷酸氫二鉀溶液-乙腈（75∶25）為流動(dòng)相時(shí)，維格列汀的峰形對(duì)稱，與其有關(guān)物質(zhì)、各步中間體和降解產(chǎn)物均能得到很好的分離，但由于有關(guān)物質(zhì)含量較少，所以在色譜上不能明顯表示，故未列出相應(yīng)色譜圖。通過對(duì)維格列汀原料藥的分析，其純度為99.08%，通過重結(jié)晶精制，純度達(dá)到99.64%。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可有效測(cè)定維格列汀片中的主藥和有關(guān)物質(zhì)的含量，適用于控制該制劑質(zhì)量。

[1]樊新星，徐 珽，盧 靜，等.抗糖尿病新藥維格列汀[J].中國(guó)新藥雜志，2008，17（14）：1272.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅣA.