潘振華，劉煥龍，陳雪彥，向柏，方瑜，張永健#

（1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊市050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，石家莊市 050017；3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，石家莊市 050003）

SUD-35/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備及其小鼠體內(nèi)藥效學(xué)初步研究

潘振華1＊，劉煥龍2，陳雪彥3，向柏1，方瑜1，張永健3#

（1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊市050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，石家莊市 050017；3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，石家莊市 050003）

目的：制備苯甲酰脲類微管微絲抑制劑SUD-35/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物（SUD-35/HP-β-CD），以提高SUD-35的水溶性和穩(wěn)定性，并對(duì)其小鼠體內(nèi)藥效學(xué)進(jìn)行初步考察。方法：采用飽和水溶液法，以SUD-35/HP-β-CD投藥比（A）、包合溫度（B）、包合時(shí)間（C）、攪拌速度（D）為考察因素，以包合率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)篩選最佳制備工藝并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)和溶解度測(cè)定；以差示掃描量熱（DSC）法及X射線衍射（XRD）法驗(yàn)證包合物；對(duì)肝癌H22細(xì)胞實(shí)體瘤模型小鼠腹腔注射包合物低、中、高劑量（以SUD-35計(jì)）每日1次，共7 d，計(jì)算末次給藥后24 h的抑瘤率，并與環(huán)磷酰胺比較。結(jié)果：最佳制備工藝為A：1∶5，B：50℃，C：60 min，D：100 r·min－1；以此工藝所制3批包合物的平均包合率約為75.8%；SUD-35原料及其包合物在水中的溶解度分別為0.000 32、0.65 g·L－1；DSC和XRD法證實(shí)包合物形成；低、中、高劑量抑瘤率分別為（38.25±0.57）%、（63.45±1.20）%、（69.26±1.15）%，環(huán)磷酰胺組為（71.52±1.16）%。結(jié)論：SUD-35/HP-β-CD包合物的制備工藝簡(jiǎn)便、易行，可極大地提高SUD-35的水溶性，其高劑量對(duì)肝癌H22細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)具有與環(huán)磷酰胺相似的抑制作用。

微管微絲抑制劑；SUD-35；羥丙基-β-環(huán)糊精；包合物；正交試驗(yàn)；小鼠；肝癌H22細(xì)胞；抑瘤率

微管和微管蛋白是靶向篩選抗腫瘤藥物的篩選模型之一。微管微絲抑制劑通過(guò)干擾細(xì)胞分裂中紡錘體的形成使細(xì)胞停滯在有絲分裂中期，阻斷細(xì)胞分裂增殖，同時(shí)由于微管微絲是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐ǖ溃蓴_微管微絲的形成可影響與凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞凋亡，該類藥物稱為微管微絲抑制劑。隨著紫杉醇的出現(xiàn)和人們對(duì)于微管微絲生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)[1]，微管微絲類抗腫瘤藥物的研究與開(kāi)發(fā)日益引起人們的關(guān)注與興趣。SUD-35（其分子量為419，屬苯甲酰脲類，化名名稱為N-[4-（4，6-二甲氧基-2-嘧啶氧基）-3-甲基苯基]-N′-[2-（二甲氨基）]苯甲酰脲）是我院藥物化學(xué)教研室全合成的新型小分子微管微絲抑制劑。由于其幾乎不溶于水，因此將其制成制劑必須首先解決其溶解性的問(wèn)題，而對(duì)藥物進(jìn)行包合則是一種解決之法。羥丙基-β-環(huán)糊精（Hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）是一種低毒、安全、有效的水溶性包合材料[2]。本試驗(yàn)采用飽和水溶液法，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選出最佳包合工藝，制備了SUD-35/HP-β-CD包合物，并對(duì)其進(jìn)行了初步的小鼠體內(nèi)藥效學(xué)考察，為其制劑的制備和臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

差示分析儀（美國(guó)PerkinElmer公司）；D/max2400轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀（日本理學(xué)株式會(huì)社）；TU-1901型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器廠）；HR型分析天平（日本AND公司）；精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥

SUD-35對(duì)照品（批號(hào)：090615，含量：99.1%）、SUD-35原料藥（批號(hào)：090618，含量：99.0%）、SUD-35/HP-β-CD包合物（批號(hào)：091216，含藥量：10.8%）均為河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室自制；HP-β-CD（西安德立生物化工有限公司，取代度：5.2）；注射用環(huán)磷酰胺（通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)：091001，規(guī)格：每支0.2 g）；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

6～8周齡清潔級(jí)昆明種小鼠，體重18～22 g，♀♂各半，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第602086號(hào)。

1.4 細(xì)胞株

小鼠肝癌H22瘤株，由河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 包合物含量測(cè)定方法

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。精密稱取SUD-35對(duì)照品及HP-β-CD適量，分別制備成一定濃度的80%甲醇溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明，SUD-35在232 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，而HP-β-CD在此處無(wú)干擾，故選232 nm波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。光譜見(jiàn)圖1。

圖1 紫外掃描光譜圖Fig 1 UV scanning spectrum

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取SUD-35對(duì)照品20 mg，置于100 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，作為貯備液。精密量取貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、6.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，在232 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），以吸光度對(duì)濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝0.080 2c+0.000 3（r2＝0.999 6）。結(jié)果，SUD-35檢測(cè)濃度線性范圍為1.0～12.0 μg·mL－1。

2.1.3 回收率試驗(yàn)。分別精密吸取對(duì)照品貯備液制備低、中、高（1.0、6.0、12.0 μg·mL－1）3種濃度的樣品，加入相應(yīng)量的HP-β-CD（摩爾比為1∶1），測(cè)定吸光度，計(jì)算平均回收率為98.82%，RSD＝0.57%（n＝6）。

2.1.4 精密度試驗(yàn)。取“2.1.3”項(xiàng)下制備的低、中、高3種濃度溶液，按相關(guān)方法分別測(cè)定日內(nèi)及日間精密度，測(cè)得日內(nèi)RSD分別為0.71%、0.39%、0.47%（n＝6）；日間RSD分別為0.46%、0.64%、0.53%（n＝6）。

2.1.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)。用80%甲醇制備濃度為6 μg·mL－1的對(duì)照品溶液，在室溫下放置1、2、4、8、12、24 h，在232 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，結(jié)果RSD＝0.51%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 包合物的制備[3，4]

2.2.1 包合物的制備。采用飽和水溶液法，制備SUD-35/HP-β-CD包合物：精密稱取HP-β-CD，加蒸餾水適量，攪拌制成一定溫度下的飽和溶液。另精密稱取一定量的SUD-35，用適量甲醇溶解后，不斷攪拌下緩緩滴入HP-β-CD飽和溶液中，恒溫?cái)嚢柚烈?guī)定時(shí)間，放冷至室溫，置于冰箱中冷藏24 h后取出，抽濾，沉淀用適量甲醇洗滌，收集沉淀物，低溫真空干燥，得白色粉末狀包合物。

2.2.2 SUD-35/HP-β-CD包合物最佳制備工藝的選擇。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇SUD-35/HP-β-CD投藥比（A）、包合溫度（B）、包合時(shí)間（C）、攪拌速度（D）為考察因素，各取3個(gè)水平，用L9（34）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。以SUD-35包合率（包合物中SUD-35含量/投料量值）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選最佳工藝條件。其因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見(jiàn)表2、表3。

表1 因素水平表Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

由表2可知，4因素對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)影響程度由大到小排列順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即投藥比影響最大，攪拌速度影響最小。由表3可知，因素A對(duì)SUD-35的包合有顯著性影響，因此結(jié)合實(shí)際情況選定最佳包合工藝條件為A1B2C3D1，即SUD-35與HP-β-CD投藥比為1∶5，包合溫度為50℃，包合時(shí)間為90 min，攪拌速度100 r·min－1。

按上述優(yōu)選確定的方法制備包合物樣品，共3批，結(jié)果其包合率分別為74.9%、78.5%、74.0%。表明用最佳處方及工藝制備的包合物包合率較高，平均包合率為75.8%（n＝3），且結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

2.2.3 溶解度試驗(yàn)[5]。取SUD-35及其包合物適量，分別加新沸放冷的水制備成飽和溶液，渦旋30 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。取續(xù)濾液用純化水稀釋進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算。結(jié)果，SUD-35及其包合物在水中的溶解度分別為0.000 32、0.65 g·L－1，可見(jiàn)形成包合物后，SUD-35在水中的溶解度增大了2 000倍左右，這也從另一個(gè)側(cè)面說(shuō)明了包合物的形成。

2.3 包合物的鑒定

2.3.1 差示掃描量熱（DSC）法鑒定包合物。分別將SUD-35原料、HP-β-CD、HP-β-CD與SUD-35的物理混合物及SUD-35/HP-β-CD包合物進(jìn)行DSC分析。以空鋁皿為參比，另一鋁皿中放入樣品，升溫速度為10 ℃·min－1，N2流速為20 mL·min－1，升溫范圍是30～150℃。結(jié)果顯示，各不相同的波峰和吸收峰的溫度值，SUD-35為118.0℃，HP-β-CD為69 ℃，HP-β-CD與SUD-35的物理混合物分別為70℃和119℃，說(shuō)明二者的混合是物理混合。包合物完全形成新的熱分析圖，在105℃有吸收峰，證明包合物已經(jīng)形成，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2DSC圖Fig 2 DSC patterns

2.3.2 X射線衍射（XRD）試驗(yàn)。分別將SUD-35、HP-β-CD、SUD-35與HP-β-CD物理混合物、包合物約0.05 g進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件：Cu靶，Ni濾波器，電壓：20 kV，電流：20 mA，接受裂縫寬度：0.3 mm，掃描范圍：5～40°（2θ），步長(zhǎng)：0.05°·s－1。XRD試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3XRD圖Fig 3 X-ray diffraction patterns

圖3結(jié)果表明，SUD-35和HP-β-CD具有明顯不同的衍射峰，物理混合物中既有HP-β-CD的衍射峰，又有SUD-35的衍射峰，是SUD-35和HP-β-CD的衍射峰疊加。包合物不同于物理混合物，SUD-35的部分特征衍射峰消失或位移，表明確實(shí)形成了包合物。

2.4 SUD-35/HP-β-CD包合物體內(nèi)藥效學(xué)考察

2.4.1 動(dòng)物模型的建立[6]。取腹腔內(nèi)傳代7 d的肝癌H22小鼠，脫頸椎處死，用滅菌空針穿過(guò)腹肌，抽吸腹水，放入滅菌容器內(nèi)，置于冰塊上保存。腹水用滅菌生理鹽水按1∶3稀釋，制得H22腫瘤細(xì)胞懸液。無(wú)菌條件下每只小鼠右腋窩皮下注射H22腫瘤細(xì)胞懸液0.2 mL，制備H22實(shí)體瘤模型。

2.4.2 SUD-35/HP-β-CD包合物體內(nèi)抗腫瘤作用的評(píng)價(jià)。制備H22實(shí)體瘤模型后，于接種次日，50只小鼠按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為陰性對(duì)照組（腹腔注射生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照組（腹腔注射環(huán)磷酰胺（CPP）5 mg·kg－1）和包合物低、中、高劑量組（分別腹腔注射相當(dāng)于含SUD-35 5、10、15 mg·kg－1的SUD-35/HP-β-CD包合物），每日1次，共7 d（各給藥劑量根據(jù)常見(jiàn)抗腫瘤藥物紫杉醇的人用臨床劑量換算而得）。于末次給藥后24 h頸椎脫臼處死小鼠，完整剝?nèi)×鼋M織，稱瘤重，計(jì)算每組瘤重平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，按下式計(jì)算各給藥組抑瘤率：抑瘤率（%）＝（1－T/C）×100%。式中，T為實(shí)驗(yàn)組即包合物組和陽(yáng)性對(duì)照組平均瘤重，C為陰性對(duì)照組平均瘤重。各組抑瘤率結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組抑瘤率結(jié)果（x ±s，n＝10）Tab 4Tumor inhibition rate of each grou（px ±s，n＝10）

表4結(jié)果表明，SUD-35/HP-β-CD包合物對(duì)肝癌H22細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

3 討論

由于CD具有獨(dú)特的內(nèi)疏水、外親水的結(jié)構(gòu)而可與許多尺寸適宜的客體分子形成包合物，因此其常用來(lái)增加藥物的水溶性、增強(qiáng)穩(wěn)定性、降低毒副作用、控制藥物釋放、提高生物利用率。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，SUD-35與HP-β-CD簡(jiǎn)單的物理混合不能制備得到包合物。而采用飽和水溶液法，成功制得了SUD-35/HP-β-CD包合物。

利用HP-β-CD的包合，SUD-35溶解度提高了2 000倍左右，從而有可能提高SUD-35的口服生物利用度。同時(shí)，其水溶性的提高為今后開(kāi)發(fā)成多種劑型提供了研究基礎(chǔ)。

SUD-35制備成包合物后，通過(guò)其對(duì)小鼠體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SUD-35/HP-β-CD包合物對(duì)荷H22實(shí)體瘤小鼠有顯著的抑瘤作用，為其進(jìn)一步抗腫瘤研究提供了參考，因此，本實(shí)驗(yàn)具有一定的實(shí)用價(jià)值。

綜上所述，SUD-35/HP-β-CD包合物的制備工藝簡(jiǎn)便、易行，可極大地提高SUD-35的水溶性，并對(duì)肝癌H22細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。

[1] 李建農(nóng)，蔣建東.微管的生物學(xué)特性與藥物研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38（4）：311.

[2] 冉懋雄，周厚瓊.藥劑輔料與新藥開(kāi)發(fā)[J].中國(guó)藥房，1996，7（2）：53.

[3] 何仲貴.環(huán)糊精包合物技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：80-114.

[4] 陸 斌.藥物新技術(shù)與新劑型[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：40.

[5] 王 浩，顧吉晉，鄧英杰.氫氯噻嗪-β-環(huán)糊精包合物的制備[J].中國(guó)藥房，2008，19（25）：1 963.

[6] 徐叔云，卞如濂.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1 647.

Preparation of Inclusion Compound of SUD-35/HP-β-cyclodextrin and Its Pharmacodynamics Study on Mice in Vivo

PAN Zhen-hua，XIANG Bai，F(xiàn)ANG Yu（College of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）
LIU Huan-long（Dept.of Pharmacology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）
CHEN Xue-yan，ZHANG Yong-jian（Dept.of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050003，China）

OBJECTIVE：To prepare the inclusion compound of benzoylurea antitubulin SUD-35/HP-β-CD in order to increase the solubility and stability of SUD-35，and to investigate its pharmacodynamics in vivo.METHODS：The inclusion compound was prepared by saturated solution method.The preparation technology of inclusion compound was optimized by orthogonal experiments using ratio of SUD-35/HP-β-CD（A），inclusion temperature（B），inclusion time（C）and stirring rate（D）as factors and with inclusion rate as index.The validation test and solubility determination were conducted.DSC and X-ray diffraction（XRD）were used to verify the complex.Hepatic cancer H22cell solid tumor model mice were given intraperitoneal injection of inclusion compounds at low-dose，medium-dose and high-dose（SUD-35）once a day for 7 days.The tumor inhibition rate was calculated 24 h after the last administration and compared with cyclophosphamide.RESULTS：The optimal preparation technology was as follows：A ：1∶5，B：50 ℃，C：60 min，D：100 r·min－1.The average inclusion rate of 3 batches was 75.8%.The solubilities of SUD-35 raw material and inclusion compound in water were 0.000 32 g·L－1and 0.65 g·L－1.The formation of inclusion compound was verified by DSC and XRD method.The tumor inhibition rates at low-dose，medium-dose and high-dose were（38.25±0.57）%，（63.45±1.20）%，（69.26±1.15）%，the cyclophosphamide group was（71.52±1.16）%.CONCLUSION：The preparation technology of inclusion compound of SUD-35/HP-β-CD is simple and feasible.It strengthens the water-solubility of SUD-35，and the high dose of it has similar inhibition on the growth of hepatic cancer H22cells in mice with cyclophosphamide.

Antitubuli；SUD-35；HP-β-cyclodextrin；Inclusion compound；Orthogonal experiment；Mice；Hepatic cancer H22cells；Tumor inhibition rate

R943；R979.1

A

1001-0408（2011）21-1982-03

＊講師，博士研究生。研究方向：藥物新劑型及腫瘤藥理學(xué)。電話：0311-86265591。E-mail：aaapzh@sohu.com

#通訊作者：教授，博士。研究方向：心血管及腫瘤藥理學(xué)。電話：0311-86266821。E-mail：zhangyj@hebmu.edu.cn

2010-08-17

2010-09-30）