宋德平，肖根輝，王 萍，何后軍，鄔向東，黃冬艷，鄧舜洲，張文波

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，江西 南昌 330045)

副豬嗜血菌(Haemophilus parasuis，Hps)是格拉澤氏病(Glasser's disease)的病原菌，是健康豬上呼吸道的常在菌，在機(jī)體受應(yīng)激或感染導(dǎo)致免疫力下降時引起保育仔豬及青年豬發(fā)生纖維素性多發(fā)性漿膜炎[1]。近年來，豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等免疫抑制性疾病常繼發(fā)Hps感染而增加發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的損失[2]。

Hps分為15個血清型，各血清型間缺乏有效的交叉保護(hù)力，常由于疫苗血清型與發(fā)病菌血清型不同而導(dǎo)致免疫失敗。所以，目前多用藥物進(jìn)行預(yù)防和治療。但這也使得該菌對藥物的敏感性發(fā)生改變。報道顯示，近些年來Hps的耐藥性越來越嚴(yán)重，而且不同時間不同地域分離株的藥物敏感性存在較大的差異[3-5]。獲得關(guān)于Hps的藥物敏感性信息將有助于該地區(qū)對該菌引發(fā)疾病的防制。

目前，關(guān)于Hps耐藥機(jī)制的研究較少。已報道的有四環(huán)素耐藥基因tet(B)、青霉素耐藥基因blaROB及林可胺類耐藥基因lnu(C)，這些耐藥基因均位于質(zhì)粒中[6-7]。檢測四環(huán)素耐藥基因(tet)是檢測四環(huán)素耐藥性的重要手段。在眾多tet中，tet(B)是介導(dǎo)腸道菌四環(huán)素耐藥性的重要基因[8-9]。Lancashire等在對澳大利亞分離株耐藥性分析時發(fā)現(xiàn)兩個介導(dǎo)四環(huán)素耐藥的質(zhì)粒pHS-Tet和pHS-Rec，均含有tet(B)[5]。前者還含有一個質(zhì)粒轉(zhuǎn)運(yùn)基因mobABC，提示Hps的四環(huán)素耐藥性可能是獲得性的。本實驗檢測了20株江西株的藥物敏感性，獲得對江西株敏感的藥物，從而為該菌的防制提供依據(jù)。同時設(shè)計特異性引物檢測tet(B)，為研究江西株耐藥的分子機(jī)制及其與血清型和毒力之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 待檢測菌株 2008年11月～2010年3月從江西省4個市32個規(guī)?；B(yǎng)豬場的80份發(fā)生纖維素性心包炎、漿膜炎、關(guān)節(jié)炎及腦膜炎的經(jīng)臨診為Hps感染的病例中分離得到20株革蘭氏陰性、細(xì)小的多形態(tài)桿菌。經(jīng)細(xì)菌形態(tài)、生化鑒定及PCR鑒定確定為Hps，并由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 TSA和TSB購自DficoTM公司；新生小牛血清購自杭州四季青有限公司；NAD購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙片、青霉素G等共9大類57種抗生素購自杭州天和微生物試劑有限公司；ExTaqDNA聚合酶和dNTPs購自北京全式金生物有限公司；600 bp DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；DL2000 DNA Ladder購自北京天根生物科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基 每100 mL TSA和TSB培養(yǎng)基中各加入經(jīng)過濾除菌的0.05%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)1 mL及無菌新生小牛血清5 mL，混勻后立即傾倒平板。

1.4 菌株的復(fù)壯 將保存菌種以100 μL 37℃TSB溶解后接種于含NAD及新生小牛血清的TSA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后挑取單個菌落接種于新平板上，過夜培養(yǎng)。

1.5 藥物敏感性試驗 挑取復(fù)壯后的菌落3個～5個接種于TSB培養(yǎng)基中，每株菌接種2管～3管，37℃180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。將菌液調(diào)至與麥?zhǔn)媳葷峁艿?管(大約3×108cfu/mL)一致。將制備的菌液涂布TSA培養(yǎng)基，于恒溫箱內(nèi)作用15 min，待液體稍干后貼標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙片。37℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，并重復(fù)1次，取其平均值為最終抑菌直徑。依據(jù)CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，區(qū)分為耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)3種藥物感受態(tài)。

1.6 tet(B)的PCR檢測 根據(jù)NCBI登錄的標(biāo)準(zhǔn)序列(AY862435.1)設(shè)計引物，Tet(B)-1a：5'-TGGTTA GGGGCAAGTTTTGG-3'，Tet(B)-1b：5'-GAGCATTG GTAAGGCTC-3'，預(yù)期目的條帶大小為640 bp，由Invetrogen公司合成。PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min；95℃ 60 s、50℃ 60 s、72℃ 90 s，35個循環(huán)。產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性產(chǎn)物由上海英俊生物有限公司進(jìn)行雙向測序。并進(jìn)行特異性和靈敏度試驗。采用建立的方法對江西株進(jìn)行tet(B)分析。

2 結(jié) 果

2.1 Hps江西株的藥物敏感性試驗 參照CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果，各分離株對各藥物的敏感性存在一定的差異。其中，對該菌敏感性較好的藥物有：氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/棒酸、頭孢呋辛、頭孢噻吩、阿奇霉素、左氟沙星及奈替米星。所有試驗菌株對阿洛西林、萬古霉素均高度敏感。80%及以上的分離株對氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/棒酸、頭孢洛克、頭孢呋辛、頭孢噻吩、妥布霉素、阿奇霉素、左氟沙星、奈替米星等高度敏感。所有菌株對頭孢菌素的敏感性較高，在使用的14種頭孢菌素中除頭孢唑林和頭孢曲松敏感性較差外，其他藥物的敏感率為65%～90%(表1)。

表1 HPs江西株的藥物敏感性分析Table 1 Analysis of drug sensitivity in Hps Jiangxi isolates

2.2 Hps江西株的耐藥性 20株試驗菌存在不同程度的耐藥性，其中，對恩諾沙星、氨曲南、四環(huán)素、頭孢唑林、洛洛美沙星、青霉素G、羧芐青霉素、頭孢曲松、鏈霉素及林可霉素的耐受性較強(qiáng)(表2)。全部菌株均對多種藥物具有抗性，部分菌株能夠耐受5種以上的藥物，甚至有2株菌能夠耐受多達(dá)22種藥物(表2)。

2.3 Hps江西株的耐藥性與血清型之間的關(guān)系 20株江西分離株對抗生素均存在耐藥性，每一種血清型均存在耐藥菌株。由表3可見，高毒力血清型(血清4型、5型和13型)的耐藥頻數(shù)為69，占總耐藥頻數(shù)的60%，比中低毒力及無毒力血清型的耐藥頻率高，血清4型菌株的耐藥頻率與其血清型頻率相差較大，可能是由于臨床用藥種類與本實驗統(tǒng)計藥物不同所致。經(jīng)卡方檢驗表明高毒力菌株與中低毒力及無毒力血清型的耐藥性差異不顯著(p>0.05)。3株不可分型菌株的耐藥頻數(shù)為28，占總耐藥頻數(shù)的24.35%(圖 1)。

2.4 Hps江西株與其他分離株的藥物敏感性比較本實驗江西株的耐藥性普遍高于其他研究報道結(jié)果。與Zhou等的結(jié)果比較，耐藥性增幅較大的藥物有：青霉素、氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素[10]。而青霉素、氨芐西林曾被認(rèn)為是治療Hps病較為有效的藥物，長期的大量使用勢必會導(dǎo)致耐藥性的積累。四環(huán)素和慶大霉素也是豬場的常用藥物。本研究與其他國家分離株相比也存在很大的耐藥性差異，整體的耐藥性比英國分離株強(qiáng)，但與西班牙分離株相近。除對恩諾沙星的耐藥性遠(yuǎn)高于西班牙分離株外，對青霉素、氨芐西林、磺胺甲惡唑/TMP等藥物的耐藥性略低于西班牙分離株，而對頭孢噻呋和恩諾沙星的耐藥率高于西班牙分離株。因此，本實驗結(jié)果再一次證實了不同地區(qū)、不同時間分離的菌株藥物敏感性存在較大的差異。

表2 Hps江西株的耐藥表型Table 2 Resistence phenotype of Hps isolates from Jiangxi Province

表3 Hps江西株血清型與耐藥頻率分布Table 3 Distribution foH.parasuisserovars and antimicrobial antimicrobial resistance among different serovars

2.5 tet(B)PCR檢測方法的建立 應(yīng)用本研究建立的方法從江西分離株中對耐四環(huán)素的Hps中擴(kuò)增出大小約為640 bp的產(chǎn)物，與預(yù)期相符，產(chǎn)物測序后經(jīng)比對表明所擴(kuò)增的條帶為tet(B)，與NCBI上登錄的tet(B)基因序列同源性為97%～98%(圖2)。所建立的方法具有較高的靈敏度，最少檢出菌量為10-3cfu(圖3)。特異性試驗表明該方法只能擴(kuò)增出對四環(huán)素耐藥的Hps中的tet(B)基因，不能從對四環(huán)素敏感的Hps中檢測出該基因，也不能檢測出對四環(huán)素耐藥的鏈球菌、葡萄球菌、巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬沙門氏菌中的耐藥基因tet(B)(圖4)。

2.6 Hps江西株四環(huán)素耐藥基因tet(B)的檢測 運(yùn)用建立的方法檢測20株江西分離株的tet(B)基因。結(jié)果表明，在14株對四環(huán)素耐藥的菌株中，有8株菌存在tet(B)基因，7株四環(huán)素敏感菌株中未檢出該基因，另外有一株未進(jìn)行血清分型但對四環(huán)素有抗性的景德鎮(zhèn)分離株也檢測到了tet(B)基因。

3 討論

本實驗檢測了20株江西株對57種藥物的敏感性，系統(tǒng)地研究了Hps江西株的藥物敏感性。結(jié)果表明存在一些對江西株高度敏感的藥物，這些藥物可以用于豬場對該病進(jìn)行預(yù)防和治療。但江西株也存在較為嚴(yán)重的耐藥性，與其他不同地區(qū)和時間段分離株相比，江西株對四環(huán)素、青霉素及恩諾沙星等的耐藥性大大增加。全部菌株均存在多重耐藥，但大多在5種藥物以下，有部分菌株能夠耐受5種以上的藥物，甚至有2株菌能夠耐受多達(dá)22種藥物，這可能與現(xiàn)今養(yǎng)豬業(yè)大量不合理的使用抗生素有關(guān)。研究報道，在細(xì)菌分離之前使用藥物治療對細(xì)菌的分離以及分離菌對藥物的抗性有較大影響。因此，文獻(xiàn)報道中的差異非常大的抗藥性很可能與細(xì)菌分離前使用抗生素有關(guān)[11]。本研究采集的樣品前期大多使用抗生素治療過，但這也許更真實地反應(yīng)當(dāng)前分離株對藥物的耐受情況。

四環(huán)素是豬場經(jīng)常使用的保健和治療藥物，其作用機(jī)理主要通過阻止氨酰tRNA與細(xì)菌核糖體結(jié)合來抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成[11]，但不影響哺乳動物細(xì)胞核糖體及細(xì)胞功能。自1980年Mender等第一次在腸桿菌科和假單胞菌質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥基因以來，在多種病原菌內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定至少29個不同的tet基因和3個otr基因[12]。四環(huán)素耐藥性的分布存在多樣性，不同細(xì)菌、宿主種類及地理位置等都表現(xiàn)出四環(huán)素耐藥基因的差異。一般認(rèn)為，革蘭氏陰性基因細(xì)菌的耐藥機(jī)制以抗生素的導(dǎo)出泵機(jī)制為主，對豬體內(nèi)細(xì)菌及腸道細(xì)菌而言，其決定導(dǎo)出泵的耐藥性基因以tet(B)為主[13]。本研究建立了檢測tet(B)的PCR方法，并從20株江西分離株中檢測出9株菌含tet(B)基因，表明tet(B)是介導(dǎo)HPs對四環(huán)素耐藥的主要原因之一，但還可能存在其他的機(jī)制介導(dǎo)這些菌株對四環(huán)素的耐藥性，這有待于進(jìn)一步研究。

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