蘇振霞，肖 輝，陳列歡

(1.淮海工學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院甲殼素研發(fā)中心，江蘇 連云港 222003)

近十幾年來，我國水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，水產(chǎn)品產(chǎn)量居世界首位，但也不斷出現(xiàn)各種魚類疾病[1]。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起魚類疾病的主要病原菌[2-4]，目前對魚病的防治主要是利用化學(xué)藥品、抗生素或者致弱疫苗。水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗菌藥物的長期使用或?yàn)E用所引起的致病菌耐藥性問題屢見不鮮[5-6]，而濫用抗生素和用藥方法不當(dāng)是導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因。因此，應(yīng)該重視抗生素類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的正確使用。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中對于正確選用抗菌漁藥、減少耐藥性及減少經(jīng)濟(jì)損失，是十分重要和必要的。本實(shí)驗(yàn)研究3種常用喹諾酮類抗生素藥物對3種水產(chǎn)病原菌的體外藥效學(xué)特性。通過測定抑菌圈直徑、最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)及殺菌曲線，為這3種抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的正確應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種實(shí)驗(yàn)用嗜水氣單胞菌、鰻弧菌和哈維氏弧菌由淮海工學(xué)院海洋學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 藥品實(shí)驗(yàn)所用的3種抗生素為：鹽酸恩諾沙星購自太原博銳生物技術(shù)有限公司，含量≥98.5%；乳酸恩諾沙星購自江西博大動(dòng)物保健品有限公司，含量≥98.5%；乳酸諾氟沙星購自鄭州亞衛(wèi)中升生物科技有限公司，含量≥98.5%。

1.3 抑菌圈的測定 將100 μL菌液均勻涂抹于固體培養(yǎng)基平板(直徑90 mm)。嗜水氣單胞菌使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，鰻弧菌和哈維氏弧菌使用LB培養(yǎng)基。用打孔器在每個(gè)平板上打3個(gè)孔，孔中加入藥液。28℃培養(yǎng)24 h。觀察并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈。

1.4 MIC的測定 MIC的測定采用雙倍試管稀釋法[7]。

1.5 MBC的測定 在MIC試驗(yàn)基礎(chǔ)上從無細(xì)菌生長的各管取材分別涂布于相應(yīng)的無菌瓊脂平板培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察結(jié)果。瓊脂平板上無細(xì)菌生長且含藥液最少管的藥液濃度，即為該種藥物對該菌的最低殺菌濃度(Minimum bacteriacidal concentration，MBC)。

1.6 殺菌曲線 將菌種培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用鹽酸恩諾沙星做鰻弧菌的殺菌曲線，乳酸諾氟沙星做嗜水氣單胞菌和哈維氏弧菌的殺菌曲線。以各時(shí)間點(diǎn)cfu/mL值的常用對數(shù)(1og)為縱坐標(biāo)，以孵育時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，繪制不同藥液濃度下的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌圈的結(jié)果分析 目前對水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌病進(jìn)行控制的主要手段是采用抗菌藥物治療，因此在使用藥物治療細(xì)菌性疾病之前，必須測定該藥物對病原菌的抗菌作用。由表1可知，鹽酸恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好，乳酸諾氟沙星對鰻弧菌和哈維氏弧菌的抑菌效果最好。

2.2 MIC和MBC結(jié)果分析 本試驗(yàn)結(jié)果顯示鹽酸恩諾沙星對鰻弧菌的抑菌效果最好，乳酸諾氟沙星對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好(表2)，與抑菌圈的測定結(jié)果相符合。關(guān)于喹諾酮類藥物對鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的抑菌作用的研究報(bào)道不太多，樊海平等2005年報(bào)道過鹽酸恩諾沙星對鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的MIC和MBC[8]。楊雨輝2003年報(bào)道過鹽酸恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的MIC和MBC[9]。

哈維氏弧菌引起的大范圍發(fā)病會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前尚缺乏對此種菌的快速檢測技術(shù)及預(yù)防措施，因此對該菌進(jìn)行藥物抑菌活性研究是非常必要的。本試驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，乳酸諾氟沙星對哈維氏弧菌的抑菌作用最明顯，本試驗(yàn)中諾氟沙星對哈維氏弧菌的MIC為1.954 μg/mL，與郝貴杰等測得諾氟沙星粉對哈維氏弧菌的MIC 0.156 mg/L相比較具有較大的差異[10]。

不同的研究者測得的藥物抑菌活性的數(shù)值不盡相同，原因可能與藥物的純度、生產(chǎn)廠家、菌種的來源等有關(guān)。影響藥物抗菌作用測定的因素很多，菌液濃度影響藥物的MIC值，且菌液濃度變化引起MIC值大小的變化因藥物不同而異。培養(yǎng)基的選擇也會(huì)影響到藥敏試驗(yàn)的結(jié)果[11]。

鹽酸恩諾沙星和乳酸恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的殺菌效果較好，MBC為7.183 μg/mL；3種抗生素對鰻弧菌的殺菌效果都較弱，鹽酸恩諾沙星和乳酸恩諾沙星對其殺菌效果要好于乳酸諾氟沙星，MBC為62.5 μg/mL；乳酸諾氟沙星對哈維氏弧菌的殺菌效果最好，MBC為31.25 μg/mL。

表1 3種抗生素對嗜水氣單胞菌、鰻弧菌和哈維氏弧菌的抑菌圈Table 1 The inhibition zone of three FQs againstAeromonas hydrophila,Vibrio anguillarumandVibrio harveyi

表2 3種抗生素對3種病原菌的MIC和MBC(μg/mL)Table 2 The MIC&MBC values of three FQs against Aeromonas hydrophila,Vibrio anguillarumandVibrio harveyi

2.3 殺菌曲線 對照組在24 h內(nèi)以一定的速率增長，尤其在4 h～12 h內(nèi)增長速率明顯大于其它的時(shí)間段。2 MIC、4 MIC和8 MIC的乳酸諾氟沙星藥液對嗜水氣單胞菌都具有殺菌作用，隨著時(shí)間的增長殺菌作用更明顯，在24 h內(nèi)完全殺滅。其中8 MIC的乳酸諾氟沙星藥液對嗜水氣單胞菌的殺菌作用最好，在12 h內(nèi)完全殺滅(圖1)。

圖1 乳酸諾氟沙星對嗜水氣單胞菌的殺菌曲線Fig.1 Killing kinetics curve of lactic norfloxacin against Aeromonas hydrophila

對照組在24 h內(nèi)以一定的速率增長，尤其在4 h～12 h內(nèi)增長速率明顯大于其它的時(shí)間段。2 MIC、4 MIC和8 MIC的鹽酸恩諾沙星藥液對鰻弧菌都具有殺菌作用，隨著時(shí)間的增長殺菌作用更加明顯，在24 h內(nèi)全部殺滅(圖2)。

圖2 鹽酸恩諾沙星對鰻弧菌的殺菌曲線Fig.2 Killing kinetics curve of enrofloxacin hydrochloride against Vibrio anguillarum

對照組在24 h內(nèi)以一定的速率增長。2 MIC、4 MIC和8 MIC的乳酸諾氟沙星藥液對哈維氏弧菌都具有殺菌作用，隨著時(shí)間的增長殺菌作用更加明顯，在24 h內(nèi)全部殺滅。在2 h～12 h之內(nèi)2 MIC的藥液對鰻弧菌的殺菌作用與4 MIC和8 MIC的藥液相比具有較大的差別，8 MIC藥液具有更好的殺菌效果(圖 3)。

圖3 乳酸諾氟沙星對哈維氏弧菌的殺菌曲線Fig.3 Killing kinetics curve of lactic norfloxacin against Vibrio harveyi

水產(chǎn)養(yǎng)殖中的給藥方法主要有浸浴和口服，一般要求藥物為水溶性，因而使用藥物的劑量應(yīng)根據(jù)水溶性藥物的MIC與MBC值來指導(dǎo)給藥劑量。只有當(dāng)藥物在動(dòng)物體的靶組織或體液中達(dá)到MIC值時(shí)，方可起效；過低的藥物濃度，不但不能起到防止疾病流行的目的，反而會(huì)提高病原生物的耐藥性并引起動(dòng)物的肝損傷。同樣，通過殺菌曲線可見，有些藥物在短時(shí)間內(nèi)不能殺滅病原體，因此使用不同藥物浸浴防治疾病，應(yīng)保持不同的時(shí)間才能殺滅致病菌，達(dá)到控制疾病的目的。

藥物敏感性測定作為篩選藥物的主要依據(jù)，它仍將是氟喹諾酮類藥物研究的重點(diǎn)。能夠影響藥物對細(xì)菌抑制作用的因素很多，因此要科學(xué)準(zhǔn)確地測定藥物的抗菌作用，必須最大程度的減少乃至排除各種主客觀因素的影響。目前，國內(nèi)對氟喹諾酮類藥物在水產(chǎn)動(dòng)物的研究較少，為了盡快使氟喹諾酮類藥物在水產(chǎn)動(dòng)物疾病的防治中得到合理應(yīng)用，今后還有待進(jìn)一步研究FQs在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及殘留，這對于有效控制水產(chǎn)動(dòng)物常見細(xì)菌性疾病的發(fā)生和流行將有重要的意義。

[1]張明，王建華，趙毅，等.20味中藥對鰻弧菌的藥敏試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(8)：77-79.

[2]張翠娟，于宙亮，趙寶華，等.嗜水氣單胞菌研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志，2008，42(7)：46-47.

[3]陳吉祥，于德華，李筠.魚類病原鰻弧菌致病相關(guān)因子及分子生物學(xué)[J].海洋科學(xué)，2003，27(8)：11-15.

[4]徐曉津，徐斌，王軍，等.哈維氏弧菌人工感染大黃魚的組織病理學(xué)研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，48(2)：283.

[5]鄭國興，周凱.嗜水氣單胞菌歐洲鰻皮膚潰瘍分離株的耐藥性[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，1999，6(3)：69.

[6]馬國軍，曲秋芝，吳文化，等.抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2001，14(2)：73-76.

[7]戴自英，劉裕昆，汪復(fù)，等.臨床抗菌藥物學(xué)[M].北京人民衛(wèi)生出版社，1985，6-8.

[8]樊海平，曾占壯，林煜.鹽酸恩諾沙星與其他四種抗菌藥物對水產(chǎn)致病菌的體外抗菌作用[J].福建水產(chǎn)，2005，6：34-36.

[9]楊雨輝，佟恒敏，盧彤巖，等.幾種氟喹諾酮類藥物對嗜水氣單胞菌體外藥效學(xué)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34(4)：368-371.

[10]郝貴杰，沈錦玉，潘曉義，等.32種常用漁藥對大黃魚致病菌哈維氏弧菌的體外抗菌試驗(yàn)[J].中國獸藥雜志，2008，42(5)：36-39.

[11]鄭天倫.水產(chǎn)藥物抗菌作用測定研究進(jìn)展[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2007，1：58-43.