錢愛東，王 建，王春芳

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林 長春 130118)

牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)主要由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)引起的一種人獸共患傳染病[1]。目前，牛結(jié)核病的防治主要采用牛結(jié)核菌素試驗(PPD)進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)檢疫，對檢出的陽性牛進(jìn)行隔離或捕殺。然而，當(dāng)感染副結(jié)核分枝桿菌等環(huán)境中的分枝桿菌時容易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，并且不能辨別患病牛和BCG免疫牛[2-3]。應(yīng)用該防治措施不能有效地控制牛結(jié)核病，反而使該病近年來呈上升趨勢[4]。

研究證實，在M.bovisrecA基因中存在內(nèi)蛋白插入位點。在recA-a位點存在一個1320 bp的內(nèi)蛋白編碼基因，該內(nèi)蛋白只存在于M.bovis和結(jié)核分枝桿菌中，在其他分枝桿菌中均不存在，應(yīng)用該內(nèi)蛋白診斷結(jié)核病不受其他分枝桿菌的干擾[5-8]。IS6110是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)中共有的插入序列，其大小為1361 bp，為功能性轉(zhuǎn)座子[9]。IS1081在MTBC中有6個拷貝[10]。因此，本研究以M.bovis recA、IS6110和IS1081為對象建立三重PCR反應(yīng)，為研究新型診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株M.bovisValleeⅢ株購自中國獸藥監(jiān)察所；人結(jié)核臨床分離株為長春市結(jié)核病醫(yī)院惠贈；副結(jié)核分枝桿菌、草分枝桿菌、豬大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、牛葡萄球菌和豬鏈球菌均為本實驗室保存。

1.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000和dNTPs均購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收純化試劑盒購自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司。

1.3 染色體DNA的提取 將M.bovisValleeⅢ接種于改良的羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7周后按文獻(xiàn)[11]方法提取染色體DNA。

1.4 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的recA(BX248343)、IS6110(X57835)和 IS1081(X61270)基因序列，設(shè)計3對擴增引物，序列為：recA-P1(1965-1982)：5'-CGGATCACGGAATAGCGG-3'；recAP2(1117-1134)： 5'-GATGGCAGGGATGGTTGG-3'；IS6110-P1(3126-3143)：5'-TACGGTGCCCGCAAAGT G-3'； IS6110-P2(3633-3652)： 5'-TTGATCGTCTCGG CTAGTGC-3'； IS1081-P1(1268-1287)： 5'-ATCGGGT ACTCGACGCTCTG-3'；IS1081-P2(1597-1615)： 5'-G GGTGTTGGTGGTTTGCTG-3'；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 recA、IS6110和 IS1081基因的 PCR擴增以M.bovisValleeⅢ染色體DNA為模板，分別擴增recA、IS6110和IS1081基因。反應(yīng)條件為：98℃8 min，96℃ 1 min、54℃ (53.5℃、54℃)1 min、72℃1.5 min，30個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 recA、IS6110和IS1081基因PCR產(chǎn)物的純化及序列分析 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，應(yīng)用BLAST進(jìn)行序列分析。

1.7 recA-IS6110-IS1081三重PCR反應(yīng)的建立以M.bovisValleeⅢ染色體DNA為模板，在同一PCR反應(yīng)中加入引物recA-P1和recA-P2、IS6110-P1和IS6110-P2以及IS1081-P1和IS1081-P2，建立recAIS6110-IS1081三重PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(總體積為 25 μL)為：10×Buffer 2.5 μL，recA-P1、recAP2、IS6110-P1、IS6110-P2、IS1081-P1、IS1081-P2(25 pmol/μL)各 0.3 μL，dNTPs(10 mmol/μL)3 μL，TaqDNA 聚合酶 1.5 μL(5 u/μL)。PCR 反應(yīng)條件為：98℃8 min；96℃1 min、53.5℃ 1 min、72℃1.5 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.8 敏感性試驗和特異性試驗 測定模板DNA濃度，將所提取的DNA依次做10倍梯度稀釋，用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴增。均進(jìn)行5次以上的擴增反應(yīng)。用副結(jié)核分枝桿菌、草分枝桿菌、人結(jié)核臨床分離株、豬大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、牛葡萄球菌和豬鏈球菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，每次擴增反應(yīng)同時設(shè)陰性對照和以M.bovisDNA為模板的陽性對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 recA、IS6110和IS1081基因的PCR擴增及序列分析 以M.bovis染色體DNA為模板，分別對recA、IS6110和IS1081基因進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見大小約860 bp、520 bp和340 bp的DNA片段。測序結(jié)果表明，所擴增的recA、IS6110和IS1081基因大小分別為866bp、527 bp和348 bp。BLAST分析結(jié)果顯示所獲得的recA、IS6110和IS1081基因與 GenBank中登錄M.bovisAF2122/97recA、IS6110和IS1081基因的同源性均達(dá)到99%。

2.2 recA-IS6110-IS1081三重PCR反應(yīng)的建立以M.bovisValleeⅢ染色體DNA為模板，在同一PCR反應(yīng)中同時加入3個基因的引物進(jìn)行三重PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見3個DNA片段，與預(yù)期的DNA片段大小相符(圖 1)。

2.3 PCR擴增的敏感性和特異性 通過DNA分光光度法測定模板DNA濃度為390 μg/mL，將基因組DNA梯度稀釋，進(jìn)行敏感性試驗。結(jié)果表明，recA、IS6110和IS1081基因PCR擴增的敏感性分別達(dá)到585 fg、19.5 fg和19.5 fg(圖2～圖4)。特異性試驗結(jié)果表明，該PCR反應(yīng)只能擴增出M.bovis和人結(jié)核臨床分離株，其他擴增反應(yīng)結(jié)果均為陰性(圖5)。

圖1 recA-IS6110-IS1081基因三重PCR擴增Fig.1 Amplification of recA,IS6110 and IS1081 by triple PCR

圖2 recA基因敏感性試驗Fig.2 Sensitivity test of recAgene by PCR detection

圖3 IS6110基因敏感性試驗Fig.3 Sensitivity test of IS6110 gene by PCR detection

圖4 IS1081基因敏感性試驗Fig.4 Sensitivity test of IS1081 gene by PCR detection

本研究以M.bovis染色體DNA為模板，以3個特異性引物擴增recA、IS6110和IS1081基因，并建立了M.bovis三重PCR檢測方法。為進(jìn)一步研究M.bovis recA、IS6110和IS1081基因作為新型診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

2008年，謝芝勛等建立了鑒別M.bovis和結(jié)核分枝桿菌的雙重PCR快速檢測方法，檢測的敏感性達(dá)到50 pg[12]。2010年，謝志勤等根據(jù)結(jié)核分枝桿菌23SrRNA基因序列和M.bovis特殊基因序列建立了結(jié)核分枝桿菌和M.bovis雙重實時熒光PCR檢測方法，結(jié)果可檢測到10 copies模板的M.bovis和結(jié)核分枝桿菌[13]。本研究所建立的recA-IS6110-IS1081三重PCR反應(yīng)，經(jīng)敏感性和特異性試驗驗證，可做為M.bovis和結(jié)核分枝桿菌的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查工具。

圖5 特異性試驗Fig.5 Specificity tests of recA,IS6110,and IS1081 gene by PCR detection

[1]何昭陽.牛結(jié)核病研究進(jìn)展[J].預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展，2001，3(4)：34-39.

[2]Buddle B M.Use of esat-6 in the IFN-γ test for diagnosis of Tuberculosis following skin testing[J].Vet Microbiol,2001,80(1):37-46.

[3]Wedlock D N,keen D L.Effect of different adjuvants on the immune response of cattle vaccinated withMycobacterium tuberculosisculture filtrate proteins[J].Vet Immunol Immunopathol,2002,86(1-2):79-81.

[4]Tollefsen S,Vordermeier M,Ulsen I,et al.DNA injection in combination with electroporation a novel method for vaccination of farmed ruminants[J].Scandinav J Immunol,2003,57(3):229-238.

[5]Saves I,Laneelle M A,Daffe M,et al.Inteins invading mycobacterial RecA proteins[J].FEBS Lett,2000,480(2-3):221-225.

[6]Davis E O,Sedgwick S G,Colston M J.Novel structure of the recA locus of Mycobacterium tuberculosisimplies processing of the gene product[J].J Bacteriol,1991,173(18):5653-5662.

[7]Frischkorn K,Sander P,Scholz M,et al.Investigation of mycobacterialrecA function:protein introns in the RecA of pathog-enicmycobacteriado not affect competency for homologous recombination[J].Mol Microbiol,1998,29(5):1203-1214.

[8]Saves I,Lewis L A,Westrelin F,et al.Specificities and functions of the RecA and ppsl intein genes of Mycobacterium tuberculosisand application for diagnosis of tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2002,40(3):943-950.

[9]蔡宏，陳東，李君蓮，等.牛結(jié)核分枝桿菌特異性核酸探針的克隆與分析[J].中國畜禽傳染病，1996，6：13-16.

[10]Takewaki S,Okuzumi K,Ishiko H,et al.Genus-specific polymerase chain reaction for the mycobacterial dnaJ gene and species-specific oligonucleotide probes[J].J Clin Microbiol,1993,31(2):446-450.

[11]Sambrook J,Russell D W.分子克隆實驗指南(上、下冊)[M].黃培堂，王嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等，譯.3版.北京：科學(xué)出版社， 2002：10-56.

[12]謝芝勛，謝志勤，雷劍明，等.結(jié)核分枝桿菌和M.bovis的二重PCR快速檢測[J].中國人獸共患病學(xué)報，2008，24(12)：1141-1144.

[13]謝志勤，謝芝勛，劉加波，等.結(jié)核分枝桿菌和M.bovis二重實時熒光PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，40(08)：827-834.