王凌鳳，楊 濤，孫恩成，耿宏偉，秦永麗，趙 晶，蔡緒禹，劉霓紅，李文京，吳東來*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125)

藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)是一種由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的通過庫蠓等昆蟲傳播的非接觸性病毒性動(dòng)物傳染病，以發(fā)熱、白細(xì)胞減少、頰粘膜和胃腸道粘膜嚴(yán)重卡他性炎癥為主要特征。主要感染反芻類動(dòng)物，動(dòng)物感染BTV的平均死亡率為30%，綿羊可高達(dá)80%[1]。BT廣泛流行于熱帶、亞熱帶及溫帶國家，給家畜飼養(yǎng)業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須呈報(bào)性疾病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。

BTV基因組由10個(gè)雙鏈RNA節(jié)段組成，包裹于雙層衣殼內(nèi)。內(nèi)層衣殼由L3和S7基因編碼的VP3和VP7組成，VP3和VP7為病毒的群特異性抗原；外層衣殼由L2和M5基因編碼的VP2和VP5組成，VP2和VP5屬于BTV的型特異性抗原[2]。其中，VP2存在許多能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的抗原表位[3]，對(duì)BTV的型特異性起決定作用，根據(jù)中和試驗(yàn)可以將BTV劃分為24個(gè)血清型。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用原核表達(dá)的兩段重組BTV17 VP2蛋白制備了型特異性單克隆抗體(MAb)，并對(duì)其抗原表位進(jìn)行了鑒定，為BTV17型特異性檢測(cè)方法的建立和VP2蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 原核表達(dá)載體pET-30a、E.coli DH5感受態(tài)細(xì)胞、E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、pFast-VP2重組質(zhì)粒、抗BTV17型綿羊陽性血清、BTV株(1、2、3、5、8、10、11、16、17、23、24 血清型)、茨城病病毒(IBAV)均由本研究室保存；MA-104細(xì)胞、牛輪狀病毒(BRV)、牛呼腸孤病毒(RV)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所于力研究員提供；各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、DNA Marker均購于寶生物工程(大連)有限公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記的驢抗綿羊IgG、抗豬IFN-MAb、鄰苯二胺(OPD)均購自GIBCO公司；弗氏佐劑、50%PEG、50×HAT、50×HT和8-氮鳥嘌呤(8-AG)均購自SIGMA公司；IPTG購自Merck公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自AXYGEN公司；膠回收小量試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類鑒定試劑盒購于Southern Biotechnology公司；BALB/c雌鼠由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 抗原的制備與純化

1.2.1 VP2蛋白在大腸桿菌中的原核分段表達(dá) 根據(jù)GenBank中登錄的BTV17的L2基因序列(M17438.1)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，VP2-523：5'-GGTGG ATCCATGGAGTTGTTCCACGCGTTG-3'(BamHⅠ)，VP2-1770：5'-GCGAAGCTTCAAATATTGAAAAACC GCGGA-3'(Hind Ⅲ)；VP2-1561：5'-CGGGTACCATG TTTAACGCGCGCTTAAGA-3'(Kpn Ⅰ )， VP2-2868：5'-CCGAAGCTTCTAGACATTCAATAGTTTCGT-3'(HindⅢ)。以pFast-VP2重組質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增BTV VP2 A和B片段。分別將A片段與原核表達(dá)載體pET-30a經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，B片段與pET-30a經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切，膠回收連接轉(zhuǎn)化DH5α，挑單菌落提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定正確后由上海英駿公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-A和pET-B分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析和western blot鑒定(抗BTV17型綿羊血清50倍稀釋作為一抗，HRP標(biāo)記的驢抗綿羊IgG 5000倍稀釋作為二抗，具體步驟參考文獻(xiàn)[4])。

1.2.2 重組蛋白純化 以SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)，用Ni-NTA His-Band樹脂純化重組蛋白。

1.3 動(dòng)物免疫 以純化的重組蛋白VP2-A和VP2-B共同免疫6周齡BALB/c雌鼠，間隔兩周免疫一次。首免每只鼠用75 g VP2-A和75 g VP2-B加弗氏完全佐劑腹腔注射，二免和三免用100 g VP2-A和100 g VP2-B加弗氏不完全佐劑腹腔注射，三免后一周測(cè)血清抗體效價(jià)，達(dá)到要求后以二免相同的劑量不加佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3 d后取其脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.4 雜交瘤細(xì)胞株的建立 按文獻(xiàn)[5]的方法操作。

1.5 MAb的鑒定

1.5.1 MAbs的腹水制備 選取8周齡～10周齡的BABL/c雌鼠，腹腔注射0.5 mL滅菌液體石蠟，7 d后注射雜交瘤細(xì)胞，1×106～2×106個(gè)細(xì)胞/只，約7 d后收集腹水。

1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水中MAb效價(jià)的測(cè)定將雜交瘤細(xì)胞上清及MAb腹水進(jìn)行梯度稀釋，通過間接ELISA方法測(cè)定其效價(jià)。

1.5.3 MAb免疫球蛋白亞類鑒定 利用SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類鑒定試劑盒對(duì)MAb進(jìn)行亞類鑒定。

1.5.4 雜交瘤細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù) 按文獻(xiàn)[6]的方法操作。

1.5.5 MAb的western blot鑒定 將重組蛋白VP2-A和VP2-B經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，分別用雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，進(jìn)行western blot分析。

1.5.6 MAb的特異性鑒定 將 BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV10、BTV11、BTV13、BTV16、BTV17、BTV23、BTV24、IBAV 接 種 于BHK-21細(xì)胞，BRV、RV接種于MA-104細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的75%乙醇固定30 min，以MAbs腹水(10倍稀釋)為一抗，同時(shí)設(shè)立未接病毒細(xì)胞對(duì)照及陰性和陽性血清(200倍稀釋)對(duì)照，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG(50倍稀釋)為二抗，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5.7 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性檢測(cè) 將凍存的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇并多次傳代，檢測(cè)培養(yǎng)上清中抗體效價(jià)，分析雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

1.6 抗原表位的鑒定 根據(jù)篩選的MAb與兩個(gè)重組蛋白的反應(yīng)情況，對(duì)MAb所識(shí)別的抗原表位進(jìn)行初步定位，根據(jù)重組蛋白VP2-A和VP2-B重疊區(qū)域的氨基酸序列(515aa～596aa)合成8條重疊短肽，W1：KWISSPMFNARLRITK；W2：RLRITKGEIGTS KKDD；W3：TSKKDDPWNNRAVRGY；W4：RAV RGYIKSPAESLDF； W5： AESLDFVLGPYYDLRL；W6：YYDLRLLFFGETLSLK；W7：ETLSLKQEQSA VFQYL；W8：AVFQYLSQLDDF。8條短肽分別以100 ng/孔包被ELISA板，MAb腹水100倍稀釋作為一抗，同時(shí)以抗豬IFN-MAb作為對(duì)照，通過間接ELISA方法進(jìn)行鑒定。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步合成10條短肽(表1)，按上述的間接ELISA方法對(duì)MAb所識(shí)別VP2蛋白抗原表位進(jìn)行精確定位。短肽均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 針對(duì)VP2抗原表位合成的短肽Table 1 Synthesized peptides for VP2 epitopes identification

1.7 抗原表位的保守性分析 利用European Bioinformatics Institute(EBI)數(shù)據(jù)庫提供的氨基酸序列Blast程序，對(duì)鑒定出的VP2蛋白抗原表位進(jìn)行保守性分析。

2 結(jié)果

2.1 VP2蛋白在大腸桿菌中的分段表達(dá) 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-A經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，得到約5400 bp和1250 bp的兩個(gè)片段，pET-B經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切，得到約5400 bp和1300 bp的兩個(gè)片段(圖略)，與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果正確。

SDS-PAGE結(jié)果顯示，含有pET-A和pET-B的重組菌分別在28℃誘導(dǎo)8 h后均在約50 ku處出現(xiàn)一條蛋白帶，與預(yù)期相符，而未誘導(dǎo)的重組菌及空載體重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物在相應(yīng)位置無蛋白條帶(圖1)。Western blot結(jié)果表明，兩個(gè)重組蛋白在50 ku處均有特異條帶，而空載體重組菌表達(dá)對(duì)照無此條帶(圖1)；表明重組蛋白VP2-A和VP2-B均可以被抗BTV17陽性血清識(shí)別。重組蛋白主要以包涵體形式存在，用8 M尿素溶解后按照說明書進(jìn)行變性純化。

圖1 重組蛋白的SDS-PAGE分析及western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE and western blot analysis of expressed recombinant proteins

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 免疫的BALB/c鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后，經(jīng)間接ELISA篩選及3次細(xì)胞克隆純化后，得到2株分泌抗BTV17 VP2蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3F4和4H10。

2.3 MAb的鑒定

2.3.1 MAb效價(jià)及MAb免疫球蛋白亞類的測(cè)定經(jīng)間接ELISA測(cè)定MAb 3F4和4H10雜交瘤細(xì)胞上清的效價(jià)均為 1∶103，腹水效價(jià)均為 1∶105；2 株MAbs亞類均為IgG1/κ鏈。

2.3.2 雜交瘤細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù) MAb 3F4和4H10雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)分別為99條和100條，具有雜交瘤細(xì)胞染色體特征。

2.3.3 MAb的western blot鑒定 分別用2株MAb檢測(cè)原核表達(dá)產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)置空載體重組菌表達(dá)對(duì)照。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，2株MAb均與重組蛋白VP2-A和VP2-B特異性結(jié)合，與空載體重組菌對(duì)照無反應(yīng)。

圖2 2株MAb的western blot鑒定結(jié)果Fig.2 Western blot identification of MAb reacted with VP2 expressed inE.coli

2.3.4 MAb的特異性鑒定 分別用2株MAbs檢測(cè)接種 BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV10、BTV11、BTV13、BTV16、BTV17、BTV23、BTV24、IBAV的BHK-21細(xì)胞及接種BRV、RV的MA-104細(xì)胞。結(jié)果表明，4H10僅與BTV17呈陽性反應(yīng)(圖3，表2)；而3F4與BTV17呈陽性反應(yīng)，與BTV10和BTV24呈弱陽性反應(yīng)，與其他病毒均呈陰性反應(yīng)(表 2)。

圖3 MAbs與BTV17的IFA鑒定Fig.3 IFA assay of MAbs reacted to BTV17 infected cells

表2 IFA鑒定MAbs的特異性結(jié)果Table 2 IFA assay of MAbs to different serotypes of BTV and IBAV,BRV,RV

2.3.5 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性檢測(cè) 將凍存3個(gè)月的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇后，檢測(cè)培養(yǎng)上清中效價(jià)為1∶103～1∶104，將雜交瘤細(xì)胞經(jīng)多次連續(xù)傳代，仍能穩(wěn)定分泌特異性MAb。

2.4 抗原表位的鑒定

2.4.1 抗原表位的初步篩選及精確定位 Western blot結(jié)果表明，MAb 3F4和4H10與重組蛋白VP2-A和VP2-B均呈特異性反應(yīng)，表明2株MAb針對(duì)的抗原表位位于兩個(gè)蛋白的重疊區(qū)，針對(duì)重疊區(qū)的氨基酸序列合成多肽對(duì)2株MAb進(jìn)行抗原表位的鑒定。8條短肽W1～W8與2株MAb的間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，2株MAb均只與W3呈陽性反應(yīng)，抗原表位初步定位在16個(gè)氨基酸區(qū)段內(nèi)。將W3前后逐級(jí)缺失5個(gè)氨基酸，合成10條短肽W9～W18包被ELISA板，間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，MAb 3F4與10條短肽均呈陽性反應(yīng)，表明W3前后5個(gè)氨基酸不是MAb 3F4所識(shí)別表位的關(guān)鍵氨基酸，從而將MAb 3F4所識(shí)別的表位精確定位為540DPWNNR545。MAb 4H10與W18呈陰性反應(yīng)，與其他9條短肽均呈陽性反應(yīng)，表明第546位的A是MAb 4H10所識(shí)別表位的一個(gè)關(guān)鍵氨基酸，從而將MAb 4H10所識(shí)別的表位精確定位為540DPWNNRA546(圖4)。

圖4 合成短肽的間接ELISA分析Fig.4 Analysis of synthetic short peptides by indirect ELISA

2.4.2 抗原表位的保守性分析 BLAST結(jié)果顯示所鑒定的兩個(gè)BTV17 VP2蛋白的抗原表位在同型病毒株中相對(duì)保守。與3F4呈弱陽性反應(yīng)的BTV10中VP2的相應(yīng)區(qū)段(540DPWSNR545)只有一個(gè)氨基酸的差異；而與BTV24 VP2的相應(yīng)區(qū)段(539DPWNNR544)一致，但出現(xiàn)一個(gè)氨基酸的移位；與其它型病毒株VP2的相應(yīng)區(qū)段具有顯著差異。

3 討論

BTV血清型眾多[7-8]，而且不同血清型之間無交互免疫性，因此預(yù)防該病的關(guān)鍵是建立快速的血清型鑒定方法對(duì)流行的BTV不同血清型做出鑒定，并采用相應(yīng)血清型的疫苗，才能有效控制該病。國內(nèi)應(yīng)用的檢測(cè)方法主要是瓊脂糖免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，間接ELISA和斑點(diǎn)ELISA，但這些方法特異性不高[5]。競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法是國際公認(rèn)的靈敏性高、特異性好的檢測(cè)方法。目前，我國僅有關(guān)于BTV群特異性MAb制備的報(bào)道[3,5]，尚無以MAb建立的病毒血清型檢測(cè)方法。本研究應(yīng)用重組表達(dá)的BTV17 VP2蛋白制備了2株BTV17型特異性MAbs，為BTV17型特異性檢測(cè)方法的建立提供了診斷試劑。

本研究曾嘗試采用純化的BTV及bac-to-bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組VP2蛋白作免疫原。由于BTV純化效果不理想，達(dá)不到免疫需要的純度和濃度，而且純化過程繁瑣，產(chǎn)量低，成本高；此外采用病毒免疫具有一定的生物安全隱患[9]。而真核表達(dá)的重組VP2蛋白量少且純化效果不好。原核表達(dá)系統(tǒng)具有高效表達(dá)的特點(diǎn)，并且可以通過標(biāo)簽蛋白制備獲得高純度的重組蛋白，有利于MAb的制備。BTV17 L2基因編碼區(qū)為2868 bp，由于長片段基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中難以表達(dá)，因此本研究采用分兩段的方法進(jìn)行表達(dá)。并采用IFA試驗(yàn)對(duì)MAb特異性做進(jìn)一步鑒定，以排除假陽性克隆[10]。

本研究以合成短肽的方法鑒定出BTV17 VP2蛋白的兩個(gè)線性抗原表位：540DPWNNR545及540DPWNNRA546。所鑒定表位與BTV10和BTV20的VP2相應(yīng)區(qū)段具有保守性。國外也曾報(bào)道過BTV10與BTV17存在共同的中和性抗原表位[11]，這可能與編碼BTV10和BTV17 VP2的L2基因間具有較高的同源性有關(guān)。通過表位序列的分析表明BTV24的VP2與MAb 3F4識(shí)別的線性抗原表位有一個(gè)氨基酸移位，使BTV24與MAb 3F4出現(xiàn)弱陽性反應(yīng)。本研究抗BTV17 VP2型特異性MAb的制備及其抗原表位的鑒定，為BTV17型特異性檢測(cè)方法建立和BTV17 VP2功能分析奠定了基礎(chǔ)，對(duì)BT的監(jiān)控及防制具有重要意義。

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