崔佳瑩，李 印，于 揚(yáng)，張文亮，鄧國(guó)華，陳化蘭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的一種禽類的感染和(或)疾病綜合征，根據(jù)AIV致病力分為非致病性禽流感病毒(NPAIV)，低致病性禽流感病毒(LPAIV)和高致病性禽流感病毒(HPAIV)3種[1]。H5N1亞型病毒株屬于HPAIV，其對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害使得該亞型AIV的快速診斷成為研究熱點(diǎn)[2-4]。

血凝素(Hemagglutinin，HA)為AIV的表面糖蛋白(75 ku)，是構(gòu)成AIV囊膜纖突的主要成分之一，直接參與了AIV的致病過程[5]，編碼HA的基因發(fā)生點(diǎn)突變引起抗原漂移是病毒HA發(fā)生抗原變異的主要原因之一[6]。本實(shí)驗(yàn)以AIV H5N1GD261作為免疫原，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備了針對(duì)其HA蛋白的單克隆抗體(MAb)，對(duì)快速檢測(cè)具有該抗原類型的AIV有著重要的應(yīng)用價(jià)值[7]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 AIV H5N1GD261分離株、骨髓瘤SP2/0細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；4周齡～6周齡及6周齡～10周齡清潔級(jí)BALB/c雌鼠購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT選擇培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基和PEG(MW1500)融合試劑、秋水仙素、滅活劑β-丙內(nèi)酯、篩選劑8-AG均購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；鼠源MAb亞類鑒定試劑盒、HRP和FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自Southern Biotech公司；底物OPD購(gòu)自Seebio Biote-chnology公司。

1.2 MAb的制備與鑒定

1.2.1 動(dòng)物免疫及MAb的制備 以H5N1GD261為免疫原，將病毒濃縮滅活后與弗氏完全佐劑等體積乳化，免疫6周齡～8周齡BALB/c小鼠，在首免后第15 d和30 d用弗氏不完全佐劑乳化的病毒加強(qiáng)免疫，細(xì)胞融合前3 d腹腔注射加強(qiáng)免疫。無(wú)菌取免疫小鼠脾臟，常規(guī)方法細(xì)胞融合，在融合后第3 d和第7 d分別對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行半量換液。

1.2.2 MAb檢測(cè)方法的建立 融合后第10 d，以4 u的病毒作檢測(cè)抗原包被ELISA板，取融合細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)，并以SP2/0培養(yǎng)上清和免疫小鼠陽(yáng)性血清分別做陰陽(yáng)性對(duì)照，初步建立篩選MAb的間接ELISA方法。判定標(biāo)準(zhǔn)為陽(yáng)性血清的OD490nm值1.0左右，P/N最大。

1.2.3 制備腹水 按照常規(guī)方法制備腹水。

1.3 MAb的鑒定

1.3.1 雜交瘤細(xì)胞染色體鑒定 采用秋水仙素法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體鑒定。

1.3.2 MAb亞類鑒定 按照Sigma公司鼠源MAb亞類鑒定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性檢測(cè) 對(duì)凍存的雜交瘤細(xì)胞株分別在第3月，第6月復(fù)蘇，連續(xù)傳4代并且收集上清液，用間接ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的抗體效價(jià)。用HI方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗體分泌能力的測(cè)定。

1.3.4 抗體效價(jià)測(cè)定 以HI實(shí)驗(yàn)測(cè)定培養(yǎng)上清和腹水的抗體效價(jià)。

1.3.5 廣譜性檢測(cè) 將細(xì)胞培養(yǎng)上清分別與H5不同病毒株進(jìn)行HI試驗(yàn)，檢測(cè)MAb的廣譜性。

1.3.6 HA亞型及病毒特異性檢測(cè) 取培養(yǎng)上清分別與AIV H1～H15亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株和新城疫病毒(NDV)進(jìn)行HI試驗(yàn)。

1.3.7 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) 將1∶100稀釋的免疫原病毒H5N1GD261接種MDCK細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48 h后冷甲醇固定細(xì)胞，以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為一抗，以FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗，同時(shí)設(shè)立未感染病毒的MDCK作為陰性對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 MAb的制備 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過4次克隆純化及ELISA和HI篩選得到3株MAb，分別命名為1A4，2F5和3D3。

2.2 MAb細(xì)胞株染色體鑒定 各MAb細(xì)胞株染色體數(shù)分別為101、108和110，該數(shù)值接近脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目之和，表明3株雜交瘤細(xì)胞為脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞。

2.3 MAb抗體亞類的鑒定 鑒定結(jié)果表明2F5為IgM類，其余2株均為IgG2a亞類，輕鏈均為κ鏈。

2.4 血凝抑制價(jià)結(jié)果 3株MAb腹水血凝抑制價(jià)分別為212、212和211，培養(yǎng)上清液的血凝抑制價(jià)分別為 29、28和 29。

2.5 廣譜性檢測(cè) 將細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別與近2年流行病學(xué)調(diào)查所采集的12株H5亞型AIV進(jìn)行HI試驗(yàn)，結(jié)果表明所制備的MAb能夠與大部分的病毒株產(chǎn)生良好反應(yīng)，具有與H5亞型較好的廣譜性(表 1)。

表1 MAb的廣譜性檢測(cè)結(jié)果Table 1 Broad spectrum of MAbs by HI test

2.6 HA亞型及病毒特異性檢測(cè) 用研制的MAb與15株亞型AIV及NDV病毒進(jìn)行HI檢測(cè)，結(jié)果表明所制備MAb與AIV其他亞型及NDV無(wú)交叉反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的特異性。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 3株雜交瘤細(xì)胞株分別在凍存后的第3個(gè)月、第6個(gè)月復(fù)蘇培養(yǎng)，經(jīng)過連續(xù)多次傳代后檢測(cè)細(xì)胞株分泌抗體的能力，用HI方法檢測(cè)培養(yǎng)液上清，HI血凝抑制價(jià)分別由29、211和211下降為26、27和27。結(jié)果表明，雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體的能力有所下降，但并未消失，穩(wěn)定性良好。

2.8 IFA結(jié)果 所獲3株MAb均與感染了相應(yīng)H5亞型AIV的MDCK發(fā)生特異性結(jié)合，熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的綠色熒光，未感染病毒的MDCK細(xì)胞未見綠色熒光(圖1)。

圖1 MAb與感染H5亞型AIV MDCK的IFA試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Identification of the MAb against H5 subtype AIV in MDCK by IFA

MAb以其特異性高、敏感性強(qiáng)被廣泛用于各類疾病病原的血清學(xué)檢測(cè)和診斷中，使用針對(duì)H5亞型HA蛋白的MAb進(jìn)行HI試驗(yàn)，可以大大提高檢測(cè)的特異性和敏感性；同時(shí)用一系列的MAb可以對(duì)研究病毒的抗原性進(jìn)行分析和歸類，為研究病毒抗原性變異規(guī)律和研究病毒HA結(jié)構(gòu)與功能提供物質(zhì)條件。本實(shí)驗(yàn)制備的MAb通過與近年分離的AIV H5亞型病毒株進(jìn)行HI試驗(yàn)分析，結(jié)果表明絕大部分新近分離株與這些MAb具有良好反應(yīng)，而與以往經(jīng)典病毒流行株標(biāo)準(zhǔn)血清反應(yīng)性相對(duì)較差，表現(xiàn)出病毒一定的差異性。這些MAb的制備為開展H5亞型AIV抗原性差異研究、病毒抗原結(jié)構(gòu)分析和完善病原學(xué)診斷研究等方面提供重要的物質(zhì)條件。

[1]葛葉，鄧國(guó)華，李雪平，等.流感病毒聚合酶PB1-1蛋白的表達(dá)與單克隆抗體的制備[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，9(31)：726-729.

[2]Reperant L A,Rimmelzwaan G F,Kuiken T.Avian influenza viruses in mammals[J].Rev Sci Tech,2009.28(1):137-159.

[3]于康震，陳化蘭，唐秀英.97香港禽流感[J].中國(guó)畜禽傳染病.1998，20(3)：187-191.

[4]Abraham A,Sivanandan V,Karunakaran D,et al.Comparative serological evaluation of avian influenza vaccine in Turkeys[J].Avian Dis,1988,32(4):659-662.

[5]邵紅霞，秦愛建，錢琨，等.抗禽流感病毒H5亞型血凝素特異性單克隆抗體的研制[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2002，19(8)：21-23.

[6]Gao Yu-mei,Zhang Ying，Shinya K,et al,Identification of amino acids in HA and PB2 critical for the transmission of H5N1 avian influenza viruses in a mammalian host[J].PLoS Pathog,2009,5(12):1000709.

[7]Nakagawa N,Maeda A,Kase T,et al.Rapid detection and identification of two lineages of influenza B strains with monoclonal antibody[J].J Virol Methods,1999,79:113-120.