彭 程,景慧慧,牟甜甜,楊文江,馬云川,張現(xiàn)忠

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 PET中心,北京 100053;2.放射性藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院,北京 100875)

18F是目前PET顯像中使用最多的核素之一,18F標(biāo)記主要通過親核取代反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。首先通過加速器質(zhì)子輻照18O富集水獲得18F-(比活度約為2.6～21.1 TBq·g-1)。通過親核取代反應(yīng)可在芳香環(huán)、雜環(huán)和脂肪鏈上取代氫或離去基團(tuán)(鹵素、硝基、季銨鹽、磺酸酯基等)直接實(shí)現(xiàn)18F標(biāo)記。生物大分子等對溫度和有機(jī)溶劑敏感,一般通過標(biāo)記合成子(Synthon)或輔助基團(tuán)(Prosthetic Group)后,利用基團(tuán)上的反應(yīng)活性部位與生物大分子上的對應(yīng)基團(tuán)在溫和條件下高效鍵合,從而實(shí)現(xiàn)放射性核素標(biāo)記。

隨著PET臨床顯像需要的日益增加,18F標(biāo)記的肽和蛋白類PET藥物引起了廣泛關(guān)注。多肽和蛋白類分子靶向性好,但結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,含有多個(gè)活性位點(diǎn),對溫度、酸堿度以及有機(jī)溶劑等較敏感,直接標(biāo)記法極易造成多肽和蛋白類分子變性而失去靶向性,需要小分子標(biāo)記中間體通過選擇性的定位反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記,所得產(chǎn)物放化純度和放化產(chǎn)率都較高[1]。N-琥珀酰亞胺-4-[18F]氟苯甲酸酯(18F-SFB)可以通過與蛋白質(zhì)或多肽中的賴氨酸殘基反應(yīng)實(shí)現(xiàn)生物分子的18F標(biāo)記,合成及純化方法簡單、放化產(chǎn)率高,標(biāo)記產(chǎn)物的體內(nèi)穩(wěn)定性較好,是最適宜的18F標(biāo)記中間體之一[2-4]。但當(dāng)生物大分子中含有大量賴氨酸殘基時(shí),18F-SFB無法確定標(biāo)記位點(diǎn)。本工作擬利用18F-SFB與N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽反應(yīng)生成另一種標(biāo)記中間體N-2-(4-[18F]氟苯甲酰氨基)乙基馬來酰亞胺(18FFBEM)[5-7]。理論上,18F-FBEM中的馬來酰亞胺雙鍵可以與巰基發(fā)生定量反應(yīng),可用于標(biāo)記帶巰基的蛋白質(zhì)和多肽分子。

研究表明[8-9],去唾液酸糖蛋白(ASGP)受體可以與含有乳糖或半乳糖殘基的分子特異性結(jié)合,利用放射性核素標(biāo)記的含有半乳糖殘基的新乳糖白蛋白類似物對肝功能進(jìn)行評價(jià)。肝受體顯像對于肝臟疾病的早期診斷以及指導(dǎo)治療和預(yù)后評價(jià)有重要的臨床意義,因此相關(guān)研究在我國具有更重要的實(shí)際意義。本研究小組與北京協(xié)和醫(yī)院、解放軍總醫(yī)院等密切合作,研制出一系列肝受體顯像劑[8-12]。

本工作擬嘗試用所合成的18F-FBEM對新乳糖白蛋白進(jìn)行標(biāo)記,制備得到一種新的18F標(biāo)記新乳糖白蛋白(18F-FBEM-NGA),并對標(biāo)記蛋白的性質(zhì)進(jìn)行初步評價(jià)。

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

18O-H2O:豐度97%,美國劍橋同位素公司產(chǎn)品;K 222(純度≥99%)、N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽(純度≥95%):Fluka公司產(chǎn)品;三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺(97%):Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品;叔丁基肼鹽酸鹽(純度為98%):Acros Oganics公司產(chǎn)品;對氟苯甲酸(純度為98%)、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(純度為99%)、O-(N-琥珀酰亞胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、N,N-二異丙基乙胺(純度為99%):Alfa Aesar公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。無水乙腈、無水DMSO均在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行無水處理并加分子篩,用封口膜密封保存。

1.2 主要儀器

X-6顯微熔點(diǎn)測定儀:北京泰克儀器有限公司產(chǎn)品;Hitachi 260-50紅外光譜儀:日本日立公司產(chǎn)品;FJ-391型同位素活度計(jì):北京核儀器廠產(chǎn)品;Venusil MP-C18柱(5μm,10 mm×250 mm):Agela Technologies Inc.產(chǎn)品;Kromasil C4柱(5μm,4.6 mm×250 mm,30 nm):瑞典Eka Chemicals產(chǎn)品;Model 626 HPLC:美國Alltech公司產(chǎn)品;Shimadu 10AVp高效液相色譜儀:日本島津公司產(chǎn)品;HiTrap脫鹽凝膠柱(Sephadex G25):GE公司提供;RDS 111回旋加速器:德國西門子公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 19 F-FBEM的合成

穩(wěn)定參考物質(zhì)19F-FBEM合成路線示于圖1。穩(wěn)定的19F-SFB按參考文獻(xiàn)[2]合成。用1.05 g對氟苯甲酸、0.86 g N-羥基琥珀酰亞胺和1.55 g N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺在四氫呋喃(THF)中0～5℃下反應(yīng)1 h。粗產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇重結(jié)晶,得到0.6 g白色針狀晶體,即為19FSFB。計(jì)算產(chǎn)率。采用1H NMR、IR對產(chǎn)品結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

取 84.3 mg19F-SFB、50 mg N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽和1 mL N,N-二異丙基乙胺在乙腈中40℃下反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后在40℃下旋干溶劑,粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析分離純化,洗脫劑為V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=50∶1,得到淺黃色粉末,即為19F-FBEM。采用1H NMR、ESI-MS對產(chǎn)品結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

2.2 18 F-FBEM的合成

18F-FBEM合成路線示于圖2。

圖1 19 F-FBEM的合成路線

圖2 18 F-FBEM的合成路線

18F-的獲得:采用RDS111回旋加速器通過18O(p,n)18F核反應(yīng)(11 MeV,30μA的質(zhì)子束流連續(xù)轟擊靶60 min)制得約22.2 GBq18F-,并用4-(4-甲基哌啶)吡啶陰離子交換樹脂(QMA分離柱)捕獲純化。

18F-FBEM的合成方法如下 。

(1)用 1 mL K 222的乙腈溶液(含 14 mg K222)和 0.5 mL K 2CO3水溶液(含 3 mg K2CO3)將18F-淋洗到反應(yīng)瓶中。120℃下用氮?dú)獯蹈伞?/p>

(2)反應(yīng)瓶中加入1 mL標(biāo)記前體 RNOTf(4 mg,11μmol)的DMSO溶液,120℃下反應(yīng)20 min。

(3)再加入0.5 mL 0.2 mol·L-1的NaOH溶液,120℃下反應(yīng)10 min。反應(yīng)液用水冷卻后,加入0.5 mL 1 mol·L-1鹽酸。

(4)將反應(yīng)液用水稀釋至約10 mL,通過活化的Sep-Pak C18柱,之后先用10 mL二次水淋洗,用氮?dú)獯蹈?然后用3 mL加1%TFA的乙腈洗脫,得到18F-FB。

(5)向18F-FB中加入30μL 40%Bu4NOH,120℃下用氮?dú)獯蹈?。加?7 mg TSTU(溶于1 mL無水乙腈),80～100℃下反應(yīng)5 min。加入500μL 5%醋酸溶液稀釋。

(6)將上述溶液用水稀釋至約10 mL,通過活化的Sep-Pak C18柱,先用10 mL二次水淋洗,用氮?dú)獯蹈?然后用2.5 mL二氯甲烷洗脫。50～60℃下用氮?dú)獯蹈啥燃淄?再加入少量乙腈,120℃下用氮?dú)獯蹈?得到18F-SFB。測量產(chǎn)品的活度,計(jì)算放化產(chǎn)率。采用HPLC分析產(chǎn)品,與穩(wěn)定參考物質(zhì)比較并測定放化純度。

(7)將1 mg N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽溶于800μL無水乙腈后加入含有18FSFB的反應(yīng)瓶中,再加入20μL N,N-二異丙基乙胺。40℃下反應(yīng)20 min,旋干乙腈,然后加入50μL三氟乙酸,得到18F-FBEM。

(8)用 600μL水稀釋18F-FBEM,用 HPLC對其進(jìn)行分離純化。加水將洗脫液稀釋至20 mL,通過活化的Sep-Pak C18柱,先用10 mL二次水淋洗,用氮?dú)獯蹈?后用3 mL乙腈洗脫,得到18F-FBEM。測量產(chǎn)品的活度,計(jì)算放化產(chǎn)率。采用HPLC分析產(chǎn)品,與穩(wěn)定參考物質(zhì)比較,并測定放化純度。

2.3 18 F-FBEM-NGA的合成

2.3.1 NGA(新乳糖白蛋白)的預(yù)處理

根據(jù)文獻(xiàn)[8-10]方法制備并預(yù)處理NGA。用含 10 mmol·L-1酒石酸鉀鈉、40 mmol·L-1鄰苯二甲酸氫鉀的溶液稀釋0.5 mol·L-1SnCl2·2H 2O的鹽酸(1 mol·L-1)溶液100倍,再用1 mol·L-1NaOH 調(diào)p H 至5.4。取出300μL該亞錫溶液加入100μL(2 mg)NGA中,此時(shí)SnCl2·2H2 O約過量 500倍,密封,室溫保存21 h后進(jìn)行標(biāo)記。

2.3.218F-FBEM-NGA的合成

18F-FBEM-NGA的合成路線示于圖3。將HiTrap脫鹽凝膠柱(Sephadex G25)用25 mL淋洗液(0.05 mol/L p H 7.5的磷酸緩沖液)平衡,控制流速在1～10 mL/min。將0.5 mL還原好的NGA用1 mL注射器上樣,先用1 mL淋洗液淋洗后,收集1 mL淋洗液,得到除去雜質(zhì)的還原NGA溶液,回收率＞95%。

圖3 18 F-FBEM-NGA的合成路線

取處理好的NGA溶液250μL溶解18FFBEM,轉(zhuǎn)移到1.5 mL小離心管中。將1 mg三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP·HCl)溶于100μL PBS(pH 7.4)后加入該反應(yīng)液中。用0.2 mol·L-1的NaOH 溶液調(diào)節(jié) p H 至 7.0～7.5。室溫反應(yīng)20 min。

將HiTrap脫鹽凝膠柱(Sephadex G25)用25 mL淋洗液(0.05 mol/L pH 7.5的磷酸緩沖液)平衡,控制流速在 1～10 mL/min。將0.25 mL標(biāo)記好的18F-FBEM-NGA用 1 mL注射器上樣,先用1 mL淋洗液淋洗后,收集1 mL淋洗液,得到除去雜質(zhì)的18F-FBEM-NGA溶液,回收率＞95%。測量活度,計(jì)算放化產(chǎn)率。HPLC分析并計(jì)算放化純度。

2.4 18F-FBEM-NGA的體外穩(wěn)定性

將經(jīng)過凝膠柱純化的18F-FBEM-NGA在室溫下磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)中放置3.5 h,用HPLC分析其放化純度。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)表征

3.1.119F-SFB的結(jié)構(gòu)鑒定

19F-SFB的 產(chǎn) 率 為 33.8%。1H NMR(CDCl3):δ:2.919(s,4H,-CH2-CH2-),7.201(t,2H,Ar-H),8.175(m,2H,Ar-H)。IR(KBr)/cm-1:ν(OH):3491,ν(-CO-O-C):1 775、1 730。結(jié)果表明,合成產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物19F-SFB。

3.1.219F-FBEM的結(jié)構(gòu)鑒定

1H NMR(CDCl3):δ:3.660(d,2H,NHCH2),3.838(d,2H,N-CH 2),6.652(s,1H,NH),6.754(s,2H,H-C=C-H),7.114(t,2H,Ar-H),7.776(t,2H,Ar-H)。IR(KBr)/cm-1:ν(NH):3 347,ν(C=O):1 706,1 625。ESI-MS:C13 H 11 FN 2O3,m/z:263.3([M+H]+),與理論值262.08基本一致。以上結(jié)果表明,合成產(chǎn)物為目的產(chǎn)物19F-FBEM。

3.2 18 F-FBEM的放化產(chǎn)率及放化純度

18F-SFB和18F-FBEM的HPLC分析結(jié)果示于圖4(所用HPLC的參數(shù)條件:Alltech高效液相色譜儀和Venusil MP-C18半制備柱;分析條件為:A相:水;B相:甲醇;流速:5 mL/min;淋洗梯度:0～5 min:5%B;5～8 min:5%B→40%B;8～25 min:40%B →90%B)。由圖4可見,18F-SFB的放射性計(jì)數(shù)峰的保留時(shí)間為18.7 min,與標(biāo)準(zhǔn)品19F-SFB的紫外吸收峰的保留時(shí)間18.6 min吻合,說明18F-SFB標(biāo)記成功;18F-FBEM的保留時(shí)間為16.7 min,與標(biāo)準(zhǔn)品19F-FBEM的紫外吸收峰的保留時(shí)間16.6min相吻合,表明18F-FBEM標(biāo)記成功。

18F-SFB衰變校正后的放化產(chǎn)率為47.9%。由18F-SFB制得18F-FBEM的反應(yīng)經(jīng)衰變校正后的放化產(chǎn)率為20.5%?？偡呕a(chǎn)率約為9.8%。放化純度大于98%。

3.3 18 F-FBEM-NGA放化產(chǎn)率及放化純度

由18F-FBEM標(biāo)記NGA得到18F-FBEMNGA的反應(yīng)經(jīng)過衰變校正后的放化產(chǎn)率為15.9%,放化純度大于98%。

有關(guān)18F-FBEM-NGA合成的HPLC分析結(jié)果示于圖 5(所用 HPLC的參數(shù)條件:Shimadu 10AVp高效液相色譜儀和 Kromasil C4柱;分析條件為:A相:水(含0.1%TFA);B相:乙腈(含0.1%TFA);流速:1 mL/min;淋洗梯度:0～30 min:30% →70%B)。由圖 5可知,18F-FBEM-NGA的保留時(shí)間為14.6 min,18F-FBEM的保留時(shí)間為5.7 min,NGA保留時(shí)間為14 min,經(jīng)過放射性標(biāo)記后,對NGA的HPLC保留時(shí)間影響不大,18F-FBEM-NGA的制備獲得成功。

國外報(bào)道18F-FBEM標(biāo)記多肽和蛋白類分子的放射性衰變校正放化產(chǎn)率為 10%～20%(以18F-為起始物計(jì)算)[5-7]。本研究的結(jié)果與之相比較低,推測原因可能與NGA的預(yù)處理方法有關(guān),亞錫對二硫鍵的還原作用可能不夠強(qiáng),導(dǎo)致與18F-FBEM反應(yīng)的自由巰基數(shù)較少。此外三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽可能會與18F-FBEM反應(yīng)[6],從而降低18F-FBEM與NGA反應(yīng)的放化產(chǎn)率。可改用其他還原劑,如DTT(1,4-二硫代蘇糖醇))對NGA進(jìn)行預(yù)處理,避免使用三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽。通過化學(xué)手段對蛋白進(jìn)行處理增加其自由巰基數(shù)量,或者蛋白與N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺先反應(yīng),增加蛋白中活性氨基數(shù)量,再利用18F-SFB進(jìn)行標(biāo)記以提高標(biāo)記率。相關(guān)研究工作正在進(jìn)行中。

3.4 18 F-FBEM-NGA的體外穩(wěn)定性

18F-FBEM-NGA室溫下放置3.5 h的HPLC分析譜示于圖5d。由圖5d可見,體外放置3.5 h后18F-FBEM-NGA放化純度大于95%,說明18F-FBEM-NGA的體外穩(wěn)定性較好。

圖4 18 F-FBEM合成的相關(guān)HPLC分析譜圖a——19 F-SFB;b——18 F-SFB;c——19F-FBEM;d——18 F-FBEM

4 小 結(jié)

本工作合成了18F-FBEM,并嘗試用18FFBEM標(biāo)記了NGA。18F-FBEM經(jīng)過放射性衰變校正放化產(chǎn)率為 9.8%,放化純度大于98%。18F-FBEM-NGA經(jīng)過放射性衰變校正放化產(chǎn)率為15.9%,放化純度大于98%。其在磷酸鹽緩沖液(p H 7.4)中室溫下放置3.5 h后,放化純度仍大于95%,可見18F-FBEM-NGA具有較好的體外穩(wěn)定性。標(biāo)記總時(shí)間約3.5 h(包括HPLC分離純化時(shí)間),自動化合成路線正在設(shè)計(jì)中。

綜上所述,利用該18F標(biāo)記輔助基團(tuán)可以有效進(jìn)行蛋白類分子的標(biāo)記,并有可能獲得不同生物性能的標(biāo)記化合物,作為改善標(biāo)記化合物性能或獲得新型標(biāo)記化合物的一種新途徑,值得進(jìn)一步研究。

圖5 18 F-FBEM-NGA合成的相關(guān)HPLC分析譜圖a——NGA;b ——18 F-FBEM-NGA;c——18F-FBEM;d—— 18 F-FBEM-NGA

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