張 偉，阮定峰，朱秀芳，于玉霞

(1.榮海生物科技有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2.諾利如一(安陽)生物科技有限公司，河南 安陽 455000)

大豆肽是大豆蛋白經(jīng)蛋白酶水解或微生物發(fā)酵等方法所制得的分子量集中在1 000 u以下并具有某些生理功能的混合低聚肽。它既具有大豆蛋白質(zhì)的營養(yǎng)學(xué)特性，又具有小分子肽所特有的物化特性，極易溶于水，在腸道中的吸收速度是普通蛋白質(zhì)的20倍、氨基酸的3倍[1]，適合蛋白質(zhì)消化吸收不佳的人群食用，如中老年人、手術(shù)后恢復(fù)期病人、腫瘤及放化療病人、胃腸功能不佳者等。

大豆蛋白質(zhì)的氨基酸組成與牛奶蛋白質(zhì)相近，是植物性的完全蛋白質(zhì)，在營養(yǎng)價值上可與動物蛋白等同，在基因結(jié)構(gòu)上也與人體最為接近，是最具營養(yǎng)的植物蛋白質(zhì)。大豆肽富含 22 種氨基酸，其中包含 9 種人體不能合成的必需氨基酸，并且 FAO/WHO(1985)人類試驗結(jié)果表明，大豆蛋白質(zhì)中必需氨基酸的組成較適合人體需要。

在肽的加工過程中其水解副產(chǎn)物主要為未水解的蛋白質(zhì)和未分離的肽，經(jīng)檢測，其蛋白質(zhì)含量和肽含量分別達到80%以上和20%以上(以干基計)。目前，對水解副產(chǎn)物大都作為飼料配料進行處理，這大大降低了其附加值。近年來，超聲波技術(shù)在蛋白酶解領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景，能夠提高蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率、縮短蛋白質(zhì)的酶解時間[2-6]。超聲波在介質(zhì)中傳播時，會產(chǎn)生熱效應(yīng)、機械效應(yīng)和空化效應(yīng)，引起介質(zhì)的一些特性變化[7]。因此，在促進活性成分的提取[8]、輔助酶解[9]和促進蛋白乳化[10]等方面起到顯著的效果，其中最為顯著的是在超聲輔助酶解方面，可以縮短酶解時間、提高酶解效率、增加產(chǎn)物得率[11]。目前對超聲輔助處理蛋白水解副產(chǎn)物提取殘留肽的研究較少。

本研究以蛋白水解副產(chǎn)物為原料(其來源于大豆分離蛋白酶解后經(jīng)超濾膜過濾分離出的副產(chǎn)物)，利用超聲處理的機械效應(yīng)和空化效應(yīng)使肽釋放并提取。在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過正交試驗對超聲處理工藝進行優(yōu)化，然后對處理后的蛋白質(zhì)水解副產(chǎn)物離心分離提取上清液，并進行肽含量分析、蛋白含量分析以及分子量分布測定。該研究提高了肽提取率，還使其分子量分布更小，為超聲在大豆肽的實際生產(chǎn)及其在食品領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白水解副產(chǎn)物(水分97.3%，肽含量(以干基計)≥20%,為大豆分離蛋白酶解后經(jīng)超濾膜過濾分離出的副產(chǎn)物)：諾利如一(安陽)生物科技有限公司；胰島素、桿菌肽、細胞血素C、人血管緊張素：Sigma公司；乙腈：色譜純；其他試劑均為分析純。

KS-180AL超聲清洗機：深圳市潔康洗凈電器有限公司；Kjeltec 8400凱氏定氮儀：美國福斯公司；S433D全氨基酸自動分析儀：德國賽卡姆Sykam 公司；ME104E萬分之一電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；KDC-40 臺式離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Thermo U-3000 高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1工藝流程

蛋白水解副產(chǎn)物→超聲處理→離心→含肽上清液

1.2.2單因素試驗

蛋白水解副產(chǎn)物(水分97.3%，肽含量(以干基計)≥20%)作為原料，加水/不加水稀釋，以超聲處理溫度、時間、功率及料液比為因素條件進行試驗。

(1)在超聲處理時間、功率、料液比一定的條件下，超聲處理溫度分別設(shè)定為30、40、50、60、70℃進行試驗。

(2)在超聲處理溫度、功率、料液比一定的條件下，超聲處理時間分別設(shè)定為10、20、30、40、50 min進行試驗。

(3)在超聲處理溫度、功率、時間一定的條件下，料液比分別設(shè)定為1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1(g/ml)進行試驗。

(4)在超聲處理溫度、時間、料液比一定的條件下，超聲處理功率分別設(shè)定為400、550、700、850、1 000 W進行試驗。

1.2.3正交實驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取超聲處理溫度、時間、功率及料液比3個水平進行L9(34)正交試驗，得到超聲處理最優(yōu)工藝。

1.2.4肽含量測定

參照國標GB/T 22492—2008大豆肽粉中肽含量檢測方法。

1.2.5肽提取率的測定

1.2.6分子量的測定

采用高效凝膠過濾色譜法測定。

色譜柱：TSKgelG2000SWXL 300 mm×7.8 mm(內(nèi)徑)；流動相：乙腈+水=20+80；檢測波長：220 nm；流速：0.5 ml/min；檢測時間：30 min；進樣體積：20 μl；柱溫：25℃(室溫)。

標準品的制備：4種分別用流動相配制成質(zhì)量濃度1 mg/ml的分子量標準品，各取2 ml，定容為10 ml。超聲脫氣10 min，用孔徑0.2～0.5 μm有機相膜過濾后進樣，得到標準品的色譜圖。以相對分子質(zhì)量的對數(shù)對保留時間作圖或作線性回歸得到相對分子質(zhì)量校正曲線及其方程。

樣品的制備：準確稱量樣品10 mg于10 ml容量瓶中，加入少許流動相，超聲10 min，用孔徑0.2～0.5 μm有機相膜過濾，進樣分析。

相對分子質(zhì)量分布的計算：將樣品進樣分析后，用GPC數(shù)據(jù)處理軟件，將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線進行計算，即可得到樣品的相對分子質(zhì)量及其分布范圍。用峰面積歸一化法計算得到不同肽段相對分子質(zhì)量的分布情況，公式如下：

計算結(jié)果保留小數(shù)點后一位。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1超聲處理溫度對蛋白水解副產(chǎn)物中肽提取率和肽含量的影響

在不稀釋情況下固定超聲時間為30 min、功率為1 000 W，研究30、40、50、60、70℃溫度下對蛋白水解副產(chǎn)物中肽提取率和肽含量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲處理溫度對肽提取率及肽含量的影響

根據(jù)圖1得出，超聲溫度越高，肽提取率先增加后趨于穩(wěn)定，超聲溫度為60℃時肽提取率最高，達到28.72%；超聲溫度為70℃時，提取物肽含量達到最大，為86.56%。溫度主要影響料液的黏度和超聲的空化作用。隨著溫度的升高，料液的黏度逐漸下降，這有利于超聲波的傳導(dǎo)，當升高到一定值時，超聲空化作用達到飽和，繼續(xù)升溫，效果不再提高，反而會造成不必要的能耗。因此綜合考慮肽提取率和上清液肽含量，選擇60℃為理想超聲溫度。

2.1.2超聲處理時間對蛋白水解副產(chǎn)物中肽提取率和分子量分布的影響

在不稀釋的情況下固定超聲溫度60℃、功率1 000 W，研究10、20、30、40、50 min處理時間下對蛋白水解副產(chǎn)物中肽提取率和肽含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲處理時間對肽提取率及肽含量的影響

根據(jù)圖2得出，超聲處理時間越長，上清液肽的提取率總體呈現(xiàn)越來越高的趨勢，在處理30 min時達到最大值28.72%，隨著時間的延長，肽提取率不再明顯提高，且上清液中肽含量隨超聲處理時間的延長變化不大；這主要是因為超聲處理30 min后肽在空化作用下被充分釋放分離，延長超聲處理時間反而會產(chǎn)生不利于蛋白溶液溶解的聚集使肽提取率下降，所以超聲處理時間選擇30 min較為合適。

2.1.3料液比對蛋白水解副產(chǎn)物中肽提取率和分子量分布的影響

固定超聲溫度60℃、功率1000 W、超聲處理時間30 min，研究料液比為1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1(g/ml)時對蛋白水解副產(chǎn)物中肽提取率和肽含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對肽提取率及肽含量的影響

根據(jù)圖3得出，在料液比為1∶0.4(g/ml)時，無論是上清液肽提取率還是上清液肽含量均達最大值，分別為37.59%和88.41%。料液比高時，物料黏度大，超聲波的傳遞受阻，影響空化作用；當料液比達到1∶0.4(g/ml)時，物料能夠充分的受到空化作用，使肽提取率最高；料液比繼續(xù)減小，蛋白物料分子受空間位阻的作用，肽提取率不再增加。所以料液比選擇1∶0.4(g/ml)較為合適。

2.1.4超聲功率對蛋白水解副產(chǎn)物中肽提取率和分子量分布的影響

固定料液比為1∶0.4(g/ml)、超聲溫度60℃、超聲處理時間30 min，研究400、550、700、850、1 000 W超聲功率下對蛋白水解副產(chǎn)物中肽提取率和肽含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對肽提取率及肽含量的影響

根據(jù)圖4得出，超聲功率逐漸增加，上清液肽的提取率和肽含量呈現(xiàn)增高趨勢，這表明超聲功率的適當增加可以提升溶液的能量密度，產(chǎn)生更強烈的空化效應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)的發(fā)生造成不同程度的改變，溶解性提升的同時使包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的肽段能夠釋放出來。而當超聲功率超過850 W后，上清液肽的提取率和肽含量出現(xiàn)明顯下降，這可能是由于過高局部熱量的產(chǎn)生使蛋白質(zhì)的構(gòu)象朝著不利于溶解的方向變化，進而導(dǎo)致肽的析出分離困難。因此，初步選定最佳超聲功率為 850 W。

2.2 正交試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以超聲處理溫度、時間、功率和料液比為考察因素，上清液肽的提取率和肽含量(以干基計)為考察指標，設(shè)計四因素三水平正交實驗，因素水平見表1，正交實驗結(jié)果及分析見表2。

表1 因素水平

表2 正交實驗結(jié)果及分析

由表2可以看出，影響上清液肽提取率的因素主次順序為料液比(C)、超聲時間(B)、超聲溫度(A)、超聲功率(D)；影響上清液蛋白肽含量的因素主次順序均為超聲功率(D)、料液比(C)、超聲溫度(A)、超聲時間(B)?？紤]到生產(chǎn)成本，在保證肽含量不低于86%的基礎(chǔ)上選擇肽提取率最高的條件，故最佳工藝組合為A1B1C1D1，在正交表中為第1組實驗，達到最高的肽提取率，即超聲溫度55℃，進超聲時間25 min，料液比1∶0.4(g/ml)，超聲功率700 W。

2.3 驗證性試驗

在上述最佳工藝條件下，通過3次平行試驗進行驗證，上清液肽提取率和肽含量(以干基計)分別為41.83%和86.13%。最佳工藝條件下與未超聲處理得到的上清液肽提取率和相對分子質(zhì)量分布比例對照結(jié)果見表3。

由表3可以看出，未經(jīng)超聲處理蛋白水解副產(chǎn)物的上清液肽提取率為15.12%，經(jīng)最優(yōu)工藝超聲處理后蛋白水解副產(chǎn)物的上清液肽提取率提高到41.83%，說明超聲處理能夠顯著提高蛋白水解副產(chǎn)物中肽的進一步提取。同時相對分子質(zhì)量在1 000 u以下的小分子肽比例從83.77%提高到90.81%，是由于超聲的空化作用對肽段產(chǎn)生分子結(jié)構(gòu)的改變。

表3 上清液肽提取率和相對分子質(zhì)量分布比例

3 結(jié)論

超聲波處理能顯著提高蛋白水解副產(chǎn)物的上清液肽提取率和肽含量，最佳的工藝條件為：超聲溫度55℃，超聲時間25 min，料液比1∶0.4(g/ml)，超聲功率700 W。在最佳工藝條件下，蛋白水解副產(chǎn)物的上清液肽提取率和肽含量(以干基計)分別達到41.83%和86.13%。與未經(jīng)超聲波處理相比，超聲處理有利于蛋白水解副產(chǎn)物中肽的進一步提取，避免了價值高的小分子肽的損失，提高了其附加值。