孫魯寧，張 寧，宋曉宇，鄭寧寧，張海鵬

代謝綜合征 (metabolic syndrome，MS)是各種代謝危險因素在同一個體中簇集的狀態(tài)，以中心性肥胖、高血糖、血脂異常、高血壓等聚集發(fā)病為特征。近年來，MS發(fā)病率在全球呈迅速上升趨勢，歐美等國家MS已累及成年人口的1/4［1］;中華醫(yī)學會糖尿病分會的一項最新調查結果顯示，我國MS的總體患病率為13.7%［2］。目前診斷MS的標準主要是依據(jù)患者的血生化檢測結果制定的，因患者的個體差異很大，僅憑血生化檢測結果往往不足以反映機體的整體代謝狀況。若能從MS的發(fā)病機制入手，在基因或蛋白質水平上找到更加理想的特異性診斷標準，無疑會對MS的臨床診治產(chǎn)生重要的意義。

線粒體是細胞代謝網(wǎng)絡的中心樞紐，它在細胞代謝過程中起著重要作用。近十多年來，線粒體功能與MS的關系正逐漸受到關注。線粒體核糖體負責線粒體基因 (mtDNA)編碼蛋白的翻譯，其異常會引起線粒體膜電位下降和能量產(chǎn)生不足，從而引起體內的各種代謝障礙，進而導致MS的發(fā)生?；诖?，本研究采用RNA干擾的方法抑制Hela細胞線粒體核糖體大亞基蛋白48(mitochondrial ribosomal proteins，MRPL48)基因的表達，觀察線粒體膜電位的改變，從而明確MRPL48在維持機體能量代謝中的作用，并進一步探討MRPL48在MS臨床診治中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 GIBCO?DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清 (Invitrogen公司);MRPL48 shRNA質粒 (Open Biosystems公司);LipofectamineTM2000轉染試劑 (Invitrogen公司);WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 (博士德公司);MRPL48抗體(Abcam公司);辣根過氧化物酶標記的兔抗人二抗 (Sant Cruz公司);硝酸纖維素膜 (Bio-Rad公司);線粒體熒光染料JC-1(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 Hela細胞培養(yǎng) 向含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，在7.5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (37°C)。

1.2.2 病毒包裝和轉染 將PA317細胞接種于6孔板，待其長滿約80%時，使用轉染試劑LipofectamineTM2000將pLNCX逆轉錄病毒表達載體和shMRPL48轉入PA317細胞，6 h后換液，24 h后收集病毒并轉染Hela細胞。

1.2.3 Western blotting方法檢測MRPL48的表達 取40μg蛋白10%SDS-PAGE電泳后轉印至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉該膜37℃ 1 h，再加入MRPL48抗體(1∶500)4℃孵育過夜。經(jīng)ECL顯影后，用電泳凝膠成像分析系統(tǒng) (Chemiimager 5500 ALPHA INNOTECH U.S.A)分析光密度值。

1.2.4 JC-1染色法觀察線粒體膜電位的變化 線粒體將產(chǎn)生的能量以電化學位能儲存于線粒體內膜，稱為線粒體膜電位，其變化可作為反映線粒體能量代謝改變的敏感指標。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以檢測到線粒體膜電位的下降。分別收集3×105RNA干擾組和對照組Hela細胞，加入0.5 mg/ml JC-1溶液，37°C避光靜置20 min后，用PBS緩沖液清洗細胞2次，用熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位變化。

2 結果

2.1 RNA干擾組和對照組Hela細胞MRPL48蛋白表達 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)分析光密度值顯示:RNA干擾組Hela細胞MRPL48蛋白表達較對照組減少58%(見圖1)，說明shRNA能有效抑制Hela細胞MRPL48蛋白的表達，從而實現(xiàn)基因沉默效應。

圖1 Western blotting檢測RNA干擾組和對照組Hela細胞MRPL48的表達Figure 1 Expression of MRPL48 in RNA interference Hela cells and the control by Western blotting

2.2 線粒體膜電位的變化 JC-1染色顯示，對照組Hela細胞線粒體染色后呈現(xiàn)紅色熒光顆粒，RNA干擾組Hela細胞線粒體綠色熒光顆粒明顯增加 (見圖2)，提示線粒體膜電位下降。

圖2 RNA干擾組和對照組Hela細胞線粒體膜電位改變 (JC-1染色，×40)Figure 2 Mitochondrial membrane potential changes of RNA interference Hela cells and the control(JC-1 staining， ×40)

3 討論

MS是由于先天的遺傳因素與后天的環(huán)境因素共同作用引發(fā)的一系列臨床、生化和體液代謝失常，從而引起糖類、脂類和蛋白質等多種物質代謝異常的綜合征［3］。因其發(fā)病率正逐年增高，且嚴重威脅人類健康，已在世界范圍內受到廣泛的關注。目前臨床上比較常用的MS診斷標準主要有3種，分別為2001年美國國家膽固醇教育計劃成人治療組第三次指南(NCEP-ATPⅢ)標準［4］，2005年國際糖尿病聯(lián)盟 (IDF)標準［5］，以及中華醫(yī)學會糖尿病學分會根據(jù)中國人MS的研究，在2004年提出的診斷標準 (CDS標準)［6］。上述3種診斷標準盡管存在一定的差異，但均是主要依據(jù)患者的臨床生化檢測結果制定的。不同的診斷標準檢出的MS臨床患病率差異較大，并且受到年齡、民族、種族、性別等多因素的影響，這就給MS的臨床診治帶來了一定的困擾［7］。故本研究試圖從MS的發(fā)病機制入手，在基因或蛋白質水平上找到更加理想的特異性診斷標準。

線粒體是細胞代謝網(wǎng)絡的中心樞紐，涵蓋和控制著約189條生化代謝系列反應，包括呼吸氧化、糖酵解、脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)、磷脂合成、蛋白質跨膜轉運路徑等。所有糖類、脂類及蛋白質代謝的最后階段都在線粒體內經(jīng)三羧酸循環(huán)完成氧化。因而，Saris等［8］提出:所有代謝障礙最終均可歸因為線粒體的功能異常。線粒體也是哺乳動物細胞內惟一含有核外遺傳物質的細胞器，線粒體基因 (mtDNA)全長僅為16.6 kb(核基因組全長為30億kb)。mtDNA的表達異常可造成線粒體電子傳遞障礙，引起線粒體的能量代謝障礙，進而參與神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腫瘤等的發(fā)生［9-10］。線粒體核糖體負責翻譯13種mtDNA編碼蛋白。作為線粒體核糖體活性中心的線粒體核糖體蛋白 (mitochondrial ribosomal proteins，MRPs)是mtDNA正常表達的基礎。它由核基因編碼，在細胞質中的核糖體上合成，然后轉運到線粒體中，參與線粒體基因的表達［11］，其結構和功能異常可能會影響mtDNA編碼蛋白的合成，使參與代謝的輔酶數(shù)量減少或活性降低，并使線粒體氧化磷酸化效率降低，導致糖類、脂類等物質代謝紊亂，同時使ATP產(chǎn)生減少，后者可進一步促進代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展。近年來，人類線粒體核糖體全部78個組成蛋白編碼基因的序列及染色體定位均已明確，使我們對MRP的進一步研究有了可能。我們的前期研究結果已證明，并非所有的MRPs異常都會引起嚴重的代謝障礙［12］。因而，從78種MRPs中鑒定出影響線粒體代謝功能的關鍵蛋白，對于從分子水平上明確MS的診斷具有尤為重要的意義。

基于上述設想，本研究采用RNA干擾的方法抑制Hela細胞MRPL48的表達，觀察到細胞線粒體膜電位下降等損傷性改變，提示此時細胞內發(fā)生了代謝障礙。也就證實了MRPL48是影響線粒體功能的關鍵蛋白質，該蛋白在細胞代謝過程中起到了非常重要的作用。MRPL48基因表達減少可能正是在MS患者在分子水平上的特異性變化。若上述設想得到證實，MRPL48將有望作為MS臨床診治的新靶點。今后，我們將繼續(xù)開展MS動物模型的研究，以便進一步提供相關的理論和實驗依據(jù)。

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3 趙崢.代謝綜合征的研究進展 ［J］.實用心腦肺血管病雜志，2011，19(1):143.

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8 Saris WH，Heymsfield SB.All metabolic roads lead to mitochondrial(dys)-function ［J］.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2007，10(6):661-663.

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