陳海英，楊 文，張 艷

(1.?？谑协偵絽^(qū)人民醫(yī)院，海南 ?？?571100;2.海南醫(yī)學(xué)院 熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心，海南 ?？?570100;3.海南省干部療養(yǎng)院，海南 海口 571100)

糖尿病時(shí)糖脂代謝紊亂，血管緊張素Ⅱ釋放增加，均可刺激活性氧(ROS)產(chǎn)生而損傷血管內(nèi)膜，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)血管病變的發(fā)生[1]。?；撬崾且环N含硫氨基酸，在眼、血管和膽囊中具有解毒和抗氧化作用，在心血管方面也有廣泛作用[2]。本研究觀察?；撬釋?duì)高糖培養(yǎng)下誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激與凋亡的影響，為防治糖尿病血管并發(fā)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

牛磺酸，北京世紀(jì)維他生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶，Sigma 公司;2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2-DCFDA)，Santa Cruz公司;DMEM培養(yǎng)基、小牛血清，Gibco公司。

丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

健康Wistar大鼠，清潔級(jí)，12周齡，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(粵)2003-0002。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

處死大鼠，取胸主動(dòng)脈，去除血管外膜及脂肪組織，組織塊法培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，在37℃，5%CO2，含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)80%融合狀態(tài)，用0.25%胰酶消化傳代，第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第4代內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞終濃度為2×105/mL，置于6孔板中，每孔10 mL，在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入葡萄糖，使其終濃度為30 mmol/L，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將細(xì)胞分成 5組，分別為 0，2.5，5，10，20 mmol/L?；撬峁才囵B(yǎng)24 h，每組3個(gè)復(fù)孔。

2.3 大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激

流式細(xì)胞儀測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS含量。細(xì)胞與?；撬嶙饔?4 h后，加入終濃度為10 μmol/L的H2-DCFDA，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱，60 min后吸去培養(yǎng)液。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞一次，用含0.01%EDTA的胰酶消化細(xì)胞，吹打制成單細(xì)胞懸液。FACScan型流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞比率[3]。比色法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA含量和SOD活性:參照試劑盒說(shuō)明，測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA含量和SOD活性，細(xì)胞蛋白質(zhì)定量采用Lowry法。

2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率

將單細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS漂洗，重復(fù)一次;用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，再以1500 r/min離心5 min，加入碘化丙啶(PI)溶液0.5 mL，終濃度為10 mg/L，室溫避光30 min后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[4]。數(shù)據(jù)以對(duì)數(shù)(log)采集，進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，計(jì)算細(xì)胞的凋亡率。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 ?；撬釋?duì)高糖誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS及凋亡的影響

結(jié)果見(jiàn)表1。0～20 mmol/L組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS熒光值依次降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與0 mmol/L組相比，5 mmol/L?；撬崮茱@著降低內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率(P＜0.05)，10 mmol/L組抑制細(xì)胞凋亡作用更顯著(P＜0.01);20與10 mmol/L?；撬嵋种频蛲鲎饔脽o(wú)顯著差異。

表1 ?；撬釋?duì)高糖誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS及凋亡的影響(，n=3)

表1 牛磺酸對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS及凋亡的影響(，n=3)

與0 mmol/L比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01

濃度/(mmol/L) ROS(熒光強(qiáng)度) 凋亡率/%09.24 ±0.12 18.52 ±1.642.5 8.15 ±0.131 18.26 ±1.1757.02 ±0.151 16.24 ±1.011 10 5.61 ±0.072 13.59 ±1.132 20 4.13 ±0.092 13.32 ±0.952

3.2 ?；撬釋?duì)高糖致大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞MDA和SOD的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。與0 mmol/L組比較，2.5 mmol/L?；撬釋?duì)MDA和SOD無(wú)明顯影響(P＞0.05);5～20 mmol/L?；撬幔琈DA含量逐漸降低，而SOD活性逐漸增強(qiáng)，各濃度組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

4 討論

糖尿病是一種由復(fù)合病因引起的以高血糖為特征的代謝綜合征，發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前認(rèn)為與遺傳、環(huán)境及自身免疫等因素相關(guān)。糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的幾率是非糖尿病患者的2～4倍，而內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是早期血管病變過(guò)程中重要的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[5]。

表2 牛磺酸對(duì)高糖致大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中MDA、SOD的影響(，n=3)

表2 ?；撬釋?duì)高糖致大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中MDA、SOD的影響(，n=3)

與0 mmol/L比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01

濃度/(mmol/L) MDA/(nmol/mg) SOD/(U/mg)06.47 ±0.49 92.55 ±16.252.5 6.26 ±0.51 94.37 ±15.6854.83 ±0.221 116.45 ±14.361 10 2.73 ±0.302 136.72 ±12.842 20 1.62 ±0.352 153.56 ±12.432

本研究通過(guò)觀察不同濃度?；撬釋?duì)高糖培養(yǎng)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激及凋亡率的變化，結(jié)果顯示，2.5～20 mmol/L?；撬釋?duì)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的抑制作用呈濃度依賴性，且各組間比較均有顯著差異;與對(duì)照組相比，2.5 mmol/L牛磺酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯影響，5～10 mmol/L?；撬嵋种苾?nèi)皮細(xì)胞凋亡作用逐漸增強(qiáng);5～20 mmol/L牛磺酸使MDA含量逐漸降低，而SOD活性逐漸增強(qiáng)。提示?；撬峥上魅躞w外高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，一定濃度?；撬峋哂锌箖?nèi)皮細(xì)胞凋亡作用。其可能機(jī)制為?；撬崾且环N具有多種生物學(xué)功能的含硫氨基酸，除能改善內(nèi)分泌狀態(tài)，增強(qiáng)人體免疫外，還有一定降血糖作用，且不依賴于增加胰島素的釋放;另外，?；撬峥赡芡ㄟ^(guò)穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗氧化、清除氧自由基等方式，對(duì)體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

總之，?；撬崮芤种苾?nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，對(duì)防治糖尿病并發(fā)血管疾病具有重要臨床意義，但其具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

[1]何 敏，徐濟(jì)良，吳 鋒.2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷及纈沙坦的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(3):354-358.

[2]臧恒昌，翟光喜，張?zhí)┧?，??；撬釕?yīng)用于心血管疾病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志，2001，22(4):215-216.

[3]柴大軍，林金秀，許昌聲，等.視黃醇類(lèi)X受體激動(dòng)劑抑制高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激[J].中華高血壓雜志，2009，17(11):1010-1014.

[4]馮月秋，王束枚，張岫美.乙酰葛根素對(duì)血管緊張素Ⅱ致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用[J].中國(guó)生化藥物雜志，2007，28(1):11-14.

[5]邱雅慧.血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能以及損傷修復(fù)與動(dòng)脈粥樣硬化[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(10):1927-1929.