石 濤，石 濱，陳一辰

(1.東南大學(xué) 附屬中大醫(yī)院，2.南京醫(yī)科大學(xué) 附屬婦幼保健院，3.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009)

急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APL)是白血病中最危重、病程發(fā)展迅速、早期死亡率最高的一種亞型，是一種特殊類型急性髓系白血病[1]。APL患者存在染色體t(15∶17)易位，形成 PML-RARα融合基因，阻礙 PML和 RARα機(jī)能，抑制骨髓細(xì)胞分化[2-4]。目前，全反式維甲酸(ATRA)與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用是當(dāng)前APL的一線及標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但其快速發(fā)展的耐藥與高復(fù)發(fā)率是影響長(zhǎng)期療效的兩大障礙。他米巴羅汀是由日本新藥株式會(huì)社研制、針對(duì)ATRA的耐藥性而開(kāi)發(fā)的一個(gè)新的RAR促進(jìn)劑，它顯示了對(duì)ATRA緩解后復(fù)發(fā)的APL具有顯著有效性[5]。本研究中采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定他米巴羅汀膠囊含量，旨在為他米巴羅汀的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

島津LC-10AT泵;島津SPD-10A紫外檢測(cè)器;HW-2000色譜工作站。

他米巴羅汀膠囊(批號(hào):20080609，20080611，20080613)，南京威爾曼藥物研究所提供;他米巴羅汀對(duì)照品(批號(hào):0801)，中國(guó)藥科大學(xué)提供;乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 取膠囊內(nèi)容物，精密稱取適量，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋成每1 mL中約含他米巴羅汀20 μg的溶液，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取他米巴羅汀對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解稀釋，制成20 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3 輔料空白溶液 取本品處方量的空白輔料置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，超聲5 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為輔料空白溶液。

2.2 色譜條件及色譜圖

色譜柱:CEC-C8柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1% 磷酸-甲醇(1∶1∶1);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):235 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

分別取供試品溶液、對(duì)照品溶液和輔料空白溶液20 μL照上述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。理論板數(shù)按他米巴羅汀峰計(jì)算不低于2500，他米巴羅汀峰與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。

圖1 他米巴羅汀HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of tamibarotene

2.3 線性試驗(yàn)

取他米巴羅汀對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解并定量制成每1 mL中約含他米巴羅汀2.5，5，10，20，40 μg/mL 的溶液，照高效液相色譜法試驗(yàn)。以濃度(C)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:A=38936 C+3391，r=0.9999。他米巴羅汀在 2.51 ～40.12 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 重復(fù)性和中間精密度試驗(yàn)

取膠囊(批號(hào):20080609)內(nèi)容物，研勻，精密稱取適量，配置成濃度為20 μg/mL的供試液。分別取對(duì)照液和供試液各20 μL注入液相色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算含量。重復(fù)6次。試驗(yàn)結(jié)果表明:本法重復(fù)性較好。

取膠囊(批號(hào):20080609)內(nèi)容物，研勻，精密稱定適量，按重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的方法，由不同的操作者、用不同的儀器、在不同的時(shí)間測(cè)定本品的含量。結(jié)合上述重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)，計(jì)算本法的中間精密度，結(jié)果的RSD為0.73%，表明本法中間精密度良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

分別精密稱取他米巴羅汀對(duì)照品16，20和24 mg(約相當(dāng)于 10倍處方量的 80%，100%，120%)放入研缽中，分別加入10倍處方量輔料，研勻;分別精密稱取適量(約相當(dāng)于他米巴羅汀2 mg)用適量流動(dòng)相溶解，超聲5 min，稀釋為10 mL，濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。另精密稱取他米巴羅汀對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并定量制成每1 mL中約含20 μg的溶液作為對(duì)照液。依高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。外標(biāo)法計(jì)算回收量及回收率，回收率均值為99.60%，RSD為0.57%，證明本法回收率較高，輔料對(duì)主藥的測(cè)定無(wú)影響。

2.6 最低檢測(cè)限試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，加流動(dòng)相溶解并制成含他米巴羅汀0.01 μg/mL 的溶液，取 20 μL 注入色譜儀，記錄色譜圖。此時(shí)主峰峰高約為基線噪音的3倍，計(jì)算最低檢測(cè)限為0.2 ng。

2.7 溶液穩(wěn)定性考察

取膠囊(批號(hào):20080609)內(nèi)容物研勻制得的粉末適量，用流動(dòng)相制得濃度為20 μg/mL的供試液，分別于0，1，2，4，6，8 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，本溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 含量測(cè)定

精密稱取膠囊內(nèi)容物研勻制得的粉末適量，加流動(dòng)相制得濃度約為20 μg/mL的供試液;另精密稱取對(duì)照品適量，用流動(dòng)相制成20 μg/mL的對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算含量。3批樣品(批號(hào):20080609，20080611，20080613)的含量分別為相當(dāng)于標(biāo)示量的 98.68%，99.22%和 99.97%。

3 討論

他米巴羅汀是一種有機(jī)酸，分子的極性較強(qiáng)。在本實(shí)驗(yàn)中選用了反相色譜系統(tǒng)，在選擇色譜柱時(shí)，比較了 Kromasil C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)和CEC-C18柱 (150 mm ×4.6 mm，5 μm)，前者他米巴羅汀在37.136 min出峰，保留時(shí)間較長(zhǎng)，而后者他米巴羅汀在13.014 min出峰，因此選擇CEC-C18柱。在選擇流動(dòng)相時(shí)，由于C18鏈在水相中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例應(yīng)不低于5%。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，選擇乙腈-0.1%磷酸-甲醇(1∶1∶1)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。這種色譜條件既可以使他米巴羅汀在色譜柱上有適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間，又可以有效地消除有關(guān)物質(zhì)和輔料的影響，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的方法[6]。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用本法測(cè)定他米巴羅汀的含量，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，可用于他米巴羅汀膠囊的質(zhì)量控制。

[1]劉春燕.急性早幼粒細(xì)胞白血病的克星——全反式維甲酸[J].開(kāi)卷有益:求醫(yī)問(wèn)藥，2007(3):10.

[2]Kazunori O.PML-RARα inhibitors(ATRA，tamibaroten，arsenic troxide)for acute promyelocytic leukemia[J].Jpn Soc Clin Oncol，2007(12):313-317.

[3]王杰松，陳志哲.急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療現(xiàn)狀[J].醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(11):838-840.

[4]楊立平.他米巴羅汀藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)學(xué)雜志，2008，9(7):57-60.

[5]賴樹(shù)清，須 媚.急性早幼粒細(xì)胞性白血病治療藥——他米巴羅汀(tamibarotene)[J].世界臨床藥物，2007，28(4):252-253.

[6]張麗華，黃仁杰.他米巴羅汀膠囊制備及其含量測(cè)定[J].今日藥學(xué)，2010，20(10):10-12.