金麗琴，陳秀芳，呂建新，劉明達，陳柏坤，錢 松

(溫州醫(yī)學院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學教研室，2.生命科學學院，3.附屬第一人民醫(yī)院 第八院區(qū)，4.藥學院，浙江 溫州 325035)

花色素苷是一類溶于水，無毒性，廣泛分布于植物界的多酚類黃酮化合物。有研究表明，花色素苷具有抗氧化[1-3]、抗炎、抗腫瘤[4-5]等活性，而有關(guān)其免疫調(diào)節(jié)活性的研究報道較少。本實驗從黑米中提取花色素苷，以矢車菊素-3-葡萄糖苷單體(cyanidin 3-glucoside，C3G)為陽性對照，觀察其誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞NO生成的作用，旨在探討花色素苷的免疫調(diào)節(jié)活性及其作用機制。

1 材料

黑米，市售;C3G、脂多糖(LPS)、RPMI 1640培養(yǎng)基，Sigma公司;胎牛血清，杭州四季青生物材料有限公司;紅細胞裂解液、CCK-8試劑、NO、一氧化氮合酶(NOS)檢測試劑盒，江蘇碧云天生物公司;Trizol reagent RNA提取試劑盒，Invitrogen公司;RTPCR試劑盒，寶生物(大連)有限公司;iNOS、β-actin引物序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

健康ICR小鼠，雌性，體重20～25 g，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供，溫醫(yī)動字2005-0061。

2 方法

2.1 黑米花色素苷的制備

選取外被色深黑粳米，纖維素酶酶解黑米米粒的表層，用90%乙醇浸提并終止酶解反應(yīng)，去除醇溶性雜質(zhì)，0.1 mol/L HCl溶液-55% 乙醇(15∶85)浸提液浸提，重復(fù)2次，減壓蒸餾，Amberlite XAD-7大孔吸附樹脂吸附，80%乙醇洗脫，真空抽濾去雜;減壓濃縮，經(jīng)冷凍干燥得粉末狀黑米花色素苷(black rice anthocyanin，BA)[6-7]。高效液相色譜法分析測得花色素苷純度為37.69%。

2.2 小鼠脾細胞增殖實驗

小鼠斷頸處死后，無菌操作取出脾臟，剔除系膜并將其剪碎后，置于篩網(wǎng)中研磨制備單個脾細胞懸液。用紅細胞裂解液溶解紅細胞后，用RPMI 1640培養(yǎng)液清洗2次，然后懸浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。調(diào)整脾細胞濃度為1×107/mL，按50 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板。設(shè)對照組和實驗組，對照組加入培養(yǎng)基50 μL，實驗組用RPMI 1640完全培養(yǎng)基溶解的不同濃度的BA按50 μL/孔加入，使實驗組的終濃度分別達25，50，100，200，400 μg/mL，同時設(shè)立 C3G(100 μg/mL)組。各組均設(shè)4個重復(fù)孔。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑10 μL后再孵育4 h，用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度(A)值。

2.3 小鼠巨噬細胞NOS活性和NO含量測定

小鼠斷頸處死，用預(yù)冷的RPMI 1640液6 mL灌洗腹腔，收集灌洗液，經(jīng)RPMI 1640液洗2次后，將腹腔滲出細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640液調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細胞懸液100 μL，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，洗去未貼壁細胞，貼壁的為巨噬細胞。將純化的巨噬細胞分為6組:對照組(加完全培養(yǎng)基1 mL)，BA 50，100，200 μg/mL 組，C3G(100 μg/mL)組，LPS(1 μg/mL)組;每組做4 個重復(fù)孔，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。收集上清液后洗盡培養(yǎng)液，加入NOS檢測緩沖液100 μL，再加入檢測反應(yīng)液100 μL，輕輕混勻，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，用熒光酶標儀檢測 NOS活性(激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長515 nm)。上清液中NO含量采用硝酸鹽還原酶法測定(按試劑盒說明書操作)。

2.4 巨噬細胞iNOS mRNA表達水平檢測

按2.3項下方法分離、培養(yǎng)小鼠巨噬細胞，分成4組:對照組(加完全培養(yǎng)基 1 mL)、BA(200 μg/mL)組、C3G(100 μg/mL)組、LPS(1 μg/mL)組，每組做4個重復(fù)孔，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用Trizol一步法提取總RNA，紫外分光光度法定量后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，采用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin為內(nèi)參照，根據(jù)Genebank資料，以 iNOS、β-actin mRNA為模板，用軟件 Primer 5.0設(shè)計引物，進行PCR擴增。iNOS，上游引物:5'-ACGCTCGGAACTGTAGCACA-3'，下游引物:5'-GCACATCAAAGCGGCCA-3'，擴增產(chǎn)物長度 276 bp;βactin，上游引物:5'-CCAACCGTGAAAAGATGA-3'，下游引物:5'-AGAAGGAAGGCTGGAAAA-3'，擴增產(chǎn)物長度459 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)分析處理。

2.5 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 BA對小鼠脾細胞增殖活性的影響

脾細胞在不同濃度BA的刺激下，均有不同程度的增殖，增殖活性隨BA用量的增加而增加。與對照組比較，BA 50，100，200，400 μg/mL 組能明顯促進小鼠脾細胞的增殖活性(P＜0.01)，而且有一定程度的劑量依賴效應(yīng);C3G組(100 μg/mL)促進小鼠脾細胞增殖的活性明顯強于BA各組(P＜0.01)，見表1。

表1 BA對小鼠脾細胞增殖的影響(n=4，)Tab.1 Effect of BA on the proliferation of splenocytes in mice(n=4，)

表1 BA對小鼠脾細胞增殖的影響(n=4，)Tab.1 Effect of BA on the proliferation of splenocytes in mice(n=4，)

與對照組比較:1P＜0.01;與BA組比較:2P＜0.01 1P ＜0.01 vs control group;2P ＜0.01 vs BA group

組 別 濃度/(μg/mL)A對照組 －0.255 ±0.021 BA 組 25 0.275 ±0.01350 0.416 ±0.0241 100 0.505 ±0.0651 200 0.648 ±0.0511 400 0.711 ±0.0471 C3G 組 100 0.953 ±0.0121，2

3.2 BA對小鼠巨噬細胞NO含量和NOS活性的影響

小鼠巨噬細胞NO含量，不同濃度BA組、C3G組和 LPS組顯著高于對照組(P＜0.05或 P＜0.01)，C3G 組、LPS 組顯著高于 BA 200 μg/mL 組(P ＜0.01)，見表2。

BA 100，200 μg/mL 組、C3G 組、LPS 組巨噬細胞NOS活性均明顯高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)，見表2。

表2 BA對小鼠巨噬細胞NO含量和NOS活性的影響(n=4，)Tab.2 Effect of BA on the NO synthesis and the NOS activity of macrophages in mice(n=4，))

表2 BA對小鼠巨噬細胞NO含量和NOS活性的影響(n=4，)Tab.2 Effect of BA on the NO synthesis and the NOS activity of macrophages in mice(n=4，))

與對照組比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01;與 200 μg/mL BA 組比較:3P ＜0.011P ＜0.05，2P ＜ 0.01 vs control group;3P ＜ 0.01 vs 200 μg/mL BA group

組 別 濃度A相對熒光強度/(μg/mL)540nm對照組 － 2.578 ±0.063 615.5 ±46.6 BA 組 50 2.825 ±0.1861 632.5 ±25.9100 2.908 ±0.1672 750.5 ±77.41 200 2.963 ±0.2062 739.5 ±88.71 C3G 組 100 3.373 ±0.1072，3 836.0 ±108.62 LPS 組 1 3.555 ±0.1092，3 802.8 ±61.82

3.3 BA對小鼠巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響

與對照組比較，巨噬細胞iNOS mRNA在C3G組、LPS組都有較強表達，而BA組無明顯表達，見圖1。

圖1 BA對小鼠巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響Fig.1 Effect of BA on the iNOS mRNA expression ofmacrophage in mice

4 討論

NO由NOS催化L-精氨酸和分子氧反應(yīng)生成。NOS是NO合成的限速酶，有3種亞型，內(nèi)皮型NOS(eNOS)、神經(jīng)元型NOS(nNOS)和誘導(dǎo)型NOS(iNOS)。iNOS是NO生成的主要限速酶[8]，生理情況下活性低，在 LPS、TNF-α、IFN-γ 等的誘導(dǎo)作用下活性增加，而iNOS活性的變化直接調(diào)控NO的產(chǎn)量及其生物學效應(yīng)。巨噬細胞作為機體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在體液免疫和細胞免疫中發(fā)揮重要作用[9]。NO合成是巨噬細胞激活的重要標志，NO作為巨噬細胞重要的效應(yīng)分子能增強巨噬細胞的溶菌和吞噬活性[10]。本實驗顯示花色素苷(包括BA和C3G)能夠使巨噬細胞NO的生成增加，進一步觀察發(fā)現(xiàn)花色素苷可以增加巨噬細胞NOS的活性。本實驗同時也發(fā)現(xiàn)花色素苷能夠促進脾細胞的增殖，使脾細胞活化。而脾細胞主要由T、B淋巴細胞組成，活化的 T、B 淋巴細胞能產(chǎn)生 TNF-α、IFN-γ、IL-2等多種細胞因子，增強機體的免疫反應(yīng)。總之，花色素苷能夠誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞NO的合成，使巨噬細胞激活，同時促進脾細胞的增殖，表明花色素苷對機體具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。

本實驗發(fā)現(xiàn)花色素苷的單體C3G作用優(yōu)于BA，提示C3G是花色素苷中非常重要的活性成分。本實驗同時也發(fā)現(xiàn)C3G可以誘導(dǎo)巨噬細胞iNOS mRNA的表達，表明C3G調(diào)節(jié)NO的合成主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平;而BA對巨噬細胞iNOS mRNA的表達無明顯影響，可能與BA中花色素苷的純度太低或其他成分影響其表達有關(guān)。

至于花色素苷促進小鼠巨噬細胞合成NO增加是否通過誘導(dǎo)巨噬細胞iNOS mRNA的表達來實現(xiàn)，以及其作用靶點、途徑如何還有待進一步研究。

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