賈 科，吳慶琛，張 成

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，重慶 400016;2.川北醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院，四川 南充 637000)

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居各類腫瘤的首位，胃癌的治療除了手術(shù)、放療和化療外，中醫(yī)藥治療也越來越受到人們的關(guān)注[1]。重樓為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖，主產(chǎn)于云南、四川及貴州等地[2]。現(xiàn)代藥理研究顯示重樓除了具有消炎、抑菌、鎮(zhèn)靜等作用外，還具有顯著的抗腫瘤作用[3]。據(jù)報(bào)道，重樓的水提物、甲醇提取物和乙醇提取物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，而皂苷是其主要藥效成分[4]。本實(shí)驗(yàn)研究重樓總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC-803生長(zhǎng)的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料

重樓藥材由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供，符合《中國藥典》(2005版一部)的規(guī)定。

RPMI 1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，美國 Sigma公司;survivin、Caspase-3兔抗人多克隆抗體和免疫組織化學(xué)二抗試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;EphA2兔抗人多克隆抗體，Santa Cruz公司;流式細(xì)胞術(shù)二抗，Jackson Immunoresearch Laboratiries Inc公司;胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)，北京華美公司。

人胃癌細(xì)胞株MGC-803，重慶市腫瘤研究所提供。

NAPCO series 5400 CO2培養(yǎng)箱，美國Nuair公司;Elx酶標(biāo)儀，Bio-TEK-Instuments Inc;EPICS XL流式細(xì)胞儀，美國COULTER公司。

2 方法

2.1 重樓總皂苷的制備

重樓藥材50 g，粉碎，加70%乙醇500 mL回流3 h，提取2次，合并濾液，減壓濃縮除去乙醇。加水懸浮，依次用石油醚、乙酸乙酯除去親脂性的成分，再用正丁醇萃取、濃縮得重樓總皂苷[5]。烘干稱重，得0.4865 g，即每1 mg重樓總皂苷相當(dāng)于重樓藥材 0.103 g。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT法檢測(cè)重樓總苷對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌細(xì)胞株MGC-803用0.25%胰蛋白酶消化后用RPMI 1640培養(yǎng)液制成2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，然后接種于96孔板，每孔100 μL，置37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液180 μL及不同濃度重樓總皂苷溶液(重樓皂苷用DMSO溶解，DMSO終體積分?jǐn)?shù)≤0.1%)20 μL，重樓總皂苷終濃度分別為10，20，40，80 和 160 μg/mL，每組設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和5-氟尿嘧啶(5-Fu)對(duì)照組。各組分別培養(yǎng)24，48，72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL ，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清液，加DMSO 150 μL/孔，振蕩溶解15 min，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率[6]。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的變化

根據(jù)MTT法檢測(cè)結(jié)果，設(shè)置空白對(duì)照組、重樓總皂苷10，20，40 μg/mL組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌細(xì)胞株MGC-803用0.25%胰蛋白酶消化后用RPMI 1640培養(yǎng)液制成2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，加入重樓總皂苷培養(yǎng)24或48 h后，用胰酶消化，收集細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，用70%乙醇懸浮細(xì)胞沉淀，于－20℃固定24 h以上。用PBS離心洗去乙醇加入碘化丙啶(PI)染液，避光染色30 min，過濾后用流式細(xì)胞儀于488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)DNA含量，分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期[7]。

2.5 重樓總皂苷對(duì)EphA2、Survivin及Caspase-3表達(dá)的影響

應(yīng)用流式細(xì)胞儀通過間接免疫熒光標(biāo)記方法進(jìn)行蛋白含量檢測(cè)。以PBS為陰性對(duì)照，以二抗為陽性對(duì)照，用同型抗體替代抗體作為同型對(duì)照。以對(duì)數(shù)方式采集數(shù)據(jù)，以樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度表示各組蛋白的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 重樓總皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

結(jié)果見表1。重樓總皂苷濃度為10～160 μg/mL時(shí)均能顯著抑制胃癌細(xì)胞株MGC-803細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且具有時(shí)間劑量依賴性和濃度依賴性。

表1 重樓總皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(，n=6)Tab.1 Effects of total saponins of paris polyphylla root on growth of gastric carcinoma cell line MGC-803(，n=6)

表1 重樓總皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(，n=6)Tab.1 Effects of total saponins of paris polyphylla root on growth of gastric carcinoma cell line MGC-803(，n=6)

與陰性對(duì)照組比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01Compared with negative control group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

組 別 濃度/(μg/mL)培養(yǎng)24 h A值 抑制率/%培養(yǎng)48 h A值 抑制率/%培養(yǎng)72 h A值 抑制率/%陰性對(duì)照組 － 0.179 ±0.011 － 0.293 ±0.016 － 0.307 ±0.019 －5-Fu 對(duì)照組 10 0.142 ±0.0102 20.7 0.213 ±0.0112 27.3 0.162 ±0.0082 47.2重樓皂苷組 10 0.153 ±0.0121 14.5 0.243 ±0.0132 20.6 0.227 ±0.0152 26.120 0.112 ±0.0132 37.4 0.173 ±0.0152 41.0 0.166 ±0.0092 45.940 0.069 ±0.0092 61.5 0.111 ±0.0062 62.1 0.104 ±0.0122 66.180 0.065 ±0.0082 63.7 0.098 ±0.0082 66.6 0.098 ±0.0132 68.1160 0.059 ±0.0102 67.0 0.087 ±0.0072 70.3 0.081 ±0.007273.6

3.2 重樓總皂苷對(duì)MGC-803細(xì)胞周期及其凋亡率的影響

結(jié)果見表2。重樓總皂苷可使胃癌細(xì)胞株MGC-803的細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，重樓總皂苷濃度為10～40 μg/mL時(shí)，隨著濃度增加，G1/G0期DNA含量降低，S期DNA含量明顯增加，G2/M期DNA含量變化不明顯，因此重樓總皂苷可使胃癌細(xì)胞株MGC-803出現(xiàn)明顯的S期阻滯。以二倍體峰(G0/G1)前出現(xiàn)亞G1峰表示凋亡細(xì)胞峰位，根據(jù)其分布組方圖計(jì)算細(xì)胞凋亡率，隨著重樓總皂苷濃度的增大，細(xì)胞凋亡率顯著升高。

3.3 重樓總皂苷對(duì) MGC-803細(xì)胞內(nèi) EphA2、survivin及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果見表3。重樓總皂苷可使胃癌細(xì)胞株MGC-803細(xì)胞內(nèi) EphA2、survivin及 Caspase-3蛋白表達(dá)發(fā)生明顯變化。重樓總皂苷濃度為10～40 μg/mL時(shí)可顯著下調(diào)EphA2和survivin蛋白的表達(dá)，而顯著上調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)。

表2 重樓總皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞周期及凋亡率的影響(，n=6)Tab.2 Effects of total saponins of paris polyphylla root on cell cycle and apoptosis rate of gastric carcinoma cell line MGC-803(，n=6)

表2 重樓總皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞周期及凋亡率的影響(，n=6)Tab.2 Effects of total saponins of paris polyphylla root on cell cycle and apoptosis rate of gastric carcinoma cell line MGC-803(，n=6)

與陰性對(duì)照組比較:1P＜0.01Compared with negative control group:1P ＜0.01

組 別 濃度/(μg/mL)培養(yǎng)24 h G1/G0 S G2/M 凋亡率/%培養(yǎng)48 h G1/G0 S G2/M 凋亡率/%陰性對(duì)照組 － 63.3 ±1.8 35.3 ±1.5 1.4 ±0.1 1.18 ±0.24 73.5 ±1.5 24.8 ±1.2 1.7 ±0.2 1.57 ±0.35重樓皂苷組 10 59.3 ±1.4139.5 ±1.611.2 ±0.2 2.32 ±0.28167.3 ±1.8131.2 ±1.411.5 ±0.1 3.25 ±0.231 20 55.2 ±1.3143.7 ±1.411.1 ±0.1 5.34 ±0.56162.4 ±1.7136.0 ±1.511.6 ±0.2 8.76 ±0.621 40 50.3 ±1.6148.4 ±1.611.3 ±0.212.76 ±0.63158.3 ±1.6140.3 ±1.611.4 ±0.115.73 ±0.521

表3 重樓總皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞內(nèi)EphA2、survivin及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響(，n=6)Tab.3 Effects of total saponins of paris polyphylla root on protein expression of EphA2，survivin and Caspase-3 of gastric carcinoma cell line MGC-803(，n=6)

表3 重樓總皂苷對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞內(nèi)EphA2、survivin及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響(，n=6)Tab.3 Effects of total saponins of paris polyphylla root on protein expression of EphA2，survivin and Caspase-3 of gastric carcinoma cell line MGC-803(，n=6)

與陰性對(duì)照組比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01Compared with negative control group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

組 別 濃度 培養(yǎng)24 h培養(yǎng)48 h/(μg/mL)EphA2 Survivin Caspase-3EphA2 Survivin Caspase-3陰性對(duì)照組 － 12.0±1.2 11.6±1.3 12.4±1.8 18.2±1.4 17.6±1.3 15.5 ±1.6重樓皂苷組 10 10.2 ±1.51 9.8 ±1.61 15.4 ±2.11 9.6 ±1.02 9.2 ±1.3217.6 ±2.41 20 8.3 ±1.32 8.0 ±1.32 23.3 ±2.92 7.9 ±0.82 7.5 ±0.9228.6 ±2.22 40 6.5 ±1.12 6.7 ±1.42 36.5 ±2.42 6.1 ±0.92 6.2 ±1.3239.3 ±2.72

4 討論

本研究采用MTT法觀察重樓總皂苷胃癌細(xì)胞株MGC-803體外生長(zhǎng)的抑制作用。重樓總皂苷濃度為10～160 μg/mL時(shí)均能顯著抑制胃癌細(xì)胞株MGC-803細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制作用隨濃度的增加而增加，并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。

有研究顯示，重樓總皂苷可觸發(fā)人低分化胃腺癌SGC-7901細(xì)胞、人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z細(xì)胞以及人肺癌細(xì)胞 A549細(xì)胞的凋亡[6，8-9]。本研究中，胃癌細(xì)胞株MGC-803經(jīng)10～40 μg/mL重樓總皂苷作用24和48 h后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明G1/G0期DNA含量降低，S期DNA含量明顯增加，因此細(xì)胞被阻滯在S期，隨著濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率增加。因此，重樓總皂苷通過改變細(xì)胞周期來誘導(dǎo)凋亡。Survivin被認(rèn)為是一種多腫瘤的通用抗原，幾乎高表達(dá)于所有的惡性腫瘤，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分裂和強(qiáng)大的抗凋亡功能[10]。Caspase-3是已知Caspase家族成員中執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵酶，是凋亡過程中最主要的終末剪切酶[7]。EphA2受體具有酪氨酸激酶活性，EphA2可高表達(dá)于多種惡性腫瘤組織，尤其高表達(dá)于高侵襲性的腫瘤細(xì)胞[11]。本研究結(jié)果顯示，隨著重樓總皂苷濃度增加，胃癌細(xì)胞株MGC-803凋亡率顯著增加，并且伴隨Survivin蛋白和EphA2蛋白表達(dá)減弱，而Caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，因此可能為誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株MGC-803凋亡的機(jī)制之一。

因此，重樓總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC-803細(xì)胞體外生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，其作用機(jī)制可能通過抑制 Survivin和 EphA2蛋白的表達(dá)以及增強(qiáng)Caspase-3蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其對(duì)胃癌的治療作用還需在體內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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