游 莉，徐蘭蘭，郭元元，鄒正渝，黎玉葉，孫雙雙，羅進勇，周 蘭

(重慶醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗系 臨床檢驗診斷學，教育部重點實驗室，重慶 400016)

S100蛋白是一類具有EF-手型的鈣調(diào)蛋白，具有多種細胞內(nèi)外的生物學功能;S100A9為該家族成員之一，是由嗜中性粒細胞和巨噬細胞在微生物成分或細胞因子刺激時分泌的促炎性蛋白，主要與S100A8以異源二聚體的形式發(fā)揮作用[1]。作為免疫原性蛋白，其高表達于各種炎性疾病和腫瘤微環(huán)境，具有促炎癥擴散、抗菌、抑制多種正常細胞(巨噬細胞、淋巴細胞、成纖維細胞等)和腫瘤細胞(乳腺癌細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞等)生長的活性[2];但是，目前也有研究表明，其能產(chǎn)生骨髓起源的抑制細胞(MDSCs)，從而促進腫瘤產(chǎn)生免疫逃逸[3]。上述研究提示S100A9在人體多種疾病如炎癥、腫瘤中發(fā)揮著重要作用，但其作用機制還有待進一步探討。

本實驗利用基因重組技術將hS100A9基因插入原核表達載體pGST-moluc，并在大腸桿菌BL21中誘導表達，再用谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads，GS4BB)分離純化出高純度的 GST-hS100A9融合蛋白，為進一步研究hS100A9蛋白的功能及其作用機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

pGST-moluc、pHAHA-hS100A9質粒由美國芝加哥大學醫(yī)學中心分子腫瘤研究室饋贈;PCR引物由Takara公司合成;高保真PCR、普通PCR、DNA連接試劑盒、限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ和 HindⅢ 購自Takara公司;膠回收、DNA純化試劑盒購自Omega公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自 Bio Basic Inc;預染的蛋白質相對分子質量(Mr)標準購自Fermertans;丙烯酰胺、還原型谷胱甘肽購自Amresco;GS4BB購自Amersharm Biosciences;hS100A9抗體購自SANTA CRUS公司;BCA蛋白測定試劑盒購自Beyotime;CCK-8試劑盒購自Dojindo公司。

1.2 pGST-hS100A9質粒的構建

1.2.1 hS100A9基因片段的獲得 以 pHAHA-hS100A9為模板，設計含BamHⅠ/HindⅢ酶切位點的hS100A9片段的引物(sense/BamHⅠ:5'-CGCGGATCCGCATGACTTGCAAAATGTCGCAG-3'，antisense/HindⅢ:5'-CCCAAGCTTTTAGGGGGTGCCCTCCCCGAG-3')，用高保真PCR擴增hS100A9片段，15g/L瓊脂糖凝膠電泳，DNA回收試劑盒回收hS100A9片段。

1.2.2 hS100A9片段與載體 pGST-moluc的連接BamHⅠ和HindⅢ雙酶切hS100A9及 pGST-moluc，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化，DNA連接試劑盒連接，連接產(chǎn)物命名為pGST-hS100A9。

1.2.3 pGST-hS100A9的鑒定 以上連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后電轉入DH5α菌，并接種于含氨芐西林(Amp)100 μg/mL的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜后挑取單個菌落接種于含Amp 100 μg/mL的LB培養(yǎng)基2 mL 中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng) 6 h，取 1.5 μL做hS100A9片段的菌液PCR。將菌液繼續(xù)擴大培養(yǎng)后提質粒，取 5 μL送測序，5 μL 用 BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。

1.3 大腸桿菌BL21的轉化

氯化鈣法制備感受態(tài)的大腸桿菌BL21，加重組質粒 pGST-hS100A9置冰浴 30 min，37℃水浴2 min，冰浴2 min;轉入預熱至37℃的LB培養(yǎng)基1 mL中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)1 h。取轉化反應液100 μL鋪于含 Amp 100 μg/mL的 LB平板培養(yǎng)，37℃過夜，挑取兩個菌落，接種到含Amp 100 μg/mL的LB培養(yǎng)基10 mL中，37℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，提質粒。

1.4 GST-hS100A9融合蛋白的表達

取上一步過夜培養(yǎng)物1.5 mL接種于含Amp 100 μg/mL的 LB培養(yǎng)基300 mL中，37℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)3 h，加入 IPTG(終濃度0.1 mmol/L)，37℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)3 h，完成融合蛋白的誘導表達。4℃，5000 r/min離心10 min收集細菌沉淀，保存于－80℃或立即進行蛋白分離純化。同步誘導表達對照蛋白GST(其質粒為pGST-moluc)。

1.5 融合蛋白的分離純化

每100 mL菌液的沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)5 mL重懸，加入蛋白酶抑制劑和終濃度為0.1%的Triton-X100，冰上超聲裂解細菌(參數(shù):振幅26%，超聲3 s，間隔3 s，總時間60 min)，冰上搖動孵育30 min。4 ℃，10000 r/min離心20 min，取上清，每10 mL上清加入50%GS4BB混懸液400 μL，冰上搖動孵育 3 h，4 ℃，1000 r/min 離心5 min，棄上清，冷PBS洗滌3次，去上清，加入洗脫緩沖液300 μL，冰上搖動洗脫3 h，4℃，1000 r/min離心5 min，重復洗脫3次，上清即為所得融合蛋白。取洗脫液20 μL進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色、凝膠成像儀成像，Quantity One軟件分析純化效果，余分裝后于－80℃保存。

1.6 Western blot鑒定融合蛋白

取適量純化所得的融合蛋白，以GST蛋白為陰性對照，加入等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸后取10 μL上樣，行SDS-PAGE和Western blot鑒定。

1.7 融合蛋白的定量

按照說明書操作，在酶標儀上測定540 nm波長處的吸光度(A)值，用A為縱坐標、牛血清白蛋白(BSA)濃度(C)為橫坐標作標準曲線，融合蛋白GST-hS100A9稀釋10倍后測定，并由此計算所制備的融合蛋白的濃度及產(chǎn)量。

1.8 GST-hS100A9對乳腺癌細胞MCF-7增殖的影響

按照CCK-8操作說明，在96孔板中接種濃度為2500個/孔的 MCF-7細胞懸液(培養(yǎng)基為含10%FBS 的 RPMI 1640)100 μL，37 ℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱12 h后將培養(yǎng)基換為含1%FBS的RPMI 1640，同時加入干預因素，實驗分為3組:空白對照組、GST對照組、GST-hS100A9組，后兩組分別加入相應蛋白使其終濃度為100 μg/mL，每組設3個復孔，于37 ℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1，2，3 d后加入 CCK-8試劑 10 μL，培養(yǎng)箱孵育 2 h后在450 nm處波長測定A值。A值采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行顯著性檢驗，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 hS100A9基因片段的獲得

用高保真PCR從pHAHA-hS100A9中擴增hS100A9基因片段，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見約360 bp的條帶(圖1)。

圖1 高保真PCR獲得hS100A9基因片段Fig.1 hS100A9 gene from high fidelity PCR

2.2 pGST-hS100A9 的鑒定

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pGST-hS100A9，正確重組的質?？梢缘玫郊s360 bp和5 kb的兩個片段。圖2所示酶切結果提示質粒重組成功。將pGST-hS100A9送測序，測序結果示hS100A9成功重組入質粒pGST-moluc(結果未顯示)。

圖2 BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定pGST-hS100A9Fig.2 pGST-hS100A9 digested with BamHⅠand HindⅢ

2.3 GST-hS100A9 的鑒定

3次洗脫共獲得融合蛋白GST-hS100A9溶液1.5 mL，將其與對照蛋白GST進行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色，結果如圖3A所示，融合蛋白Mr為36000，GST Mr為26000，與預期值相符;用 Quantity One軟件分析純化效果，GST-hS100A9純度為94%。用hS100A9抗體針對GST-hS100A9和GST行Western blot檢測，結果如圖3B所示，GST-hS100A9融合蛋白與抗體呈現(xiàn)特異反應，而GST則與該抗體沒有反應。

圖3 GST-hS100A9的SDS-PAGE鑒定(A)及Western blot鑒定(B)電泳圖Fig.3 SDS-PAGE(A)and Western blot(B)of GST-hS100A9

2.4 GST-hS100A9 的定量

BSA 的標準曲線方程為:A=0.314 C+0.005，r=0.9962，線性范圍為 20 ～2000 μg/mL。本次菌液300 mL制備hS100A9-GST融合蛋白，3次洗脫共獲得融合蛋白GST-hS100A9溶液1.5 mL，測定其蛋白濃度為4 mg/mL，因此總量為6 mg。

2.5 GST-hS100A9抑制MCF-7的增殖

CCK-8測定GST-hS100A9對MCF-7增殖的影響結果見表1?？梢?，3個時間點空白組和GST組的活細胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05)，第1天 GST-hS100A9組與空白組及GST組無明顯差異(P＞0.05)，從第2天開始，GST-hS100A9組比空白組及GST組活細胞數(shù)減少，第3天分別為空白組和GST組的75%和76%，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示GST-hS100A9抑制MCF-7細胞的增殖。

3 討論

S100蛋白是一類具有EF-手型結構的鈣調(diào)蛋白，目前發(fā)現(xiàn)該家族至少有25個成員，其中21個成員的基因定位在人染色體1q21上，該區(qū)染色體穩(wěn)定性差，易發(fā)生人染色體重排，與腫瘤關系密切[4-5]。S100A9是定位于該染色體上的S100家族成員之一。它是由嗜中性粒細胞分泌和表達的一種具有免疫原性的蛋白質，有抑制細胞生長、抗菌、抑制巨噬細胞的活化的作用[6-7]。但近來研究發(fā)現(xiàn)，S100A9可促進腫瘤微環(huán)境中骨髓起源的抑制細胞(MD-SCs)和腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)的產(chǎn)生，這兩種細胞能抑制T細胞、NK細胞、巨噬細胞的免疫殺傷功能，產(chǎn)生促細胞生長的多種細胞因子[8-12]，S100A9作為腫瘤微環(huán)境中的重要因子，有效的調(diào)控著腫瘤的動態(tài)發(fā)展過程，因此進一步探討S100A9在腫瘤中的作用及作用機制具有重要意義。

表1 GST-hS100A9作用不同時間對MCF-7增殖的影響(，n=3)Tab.1 The effects of GST-hS100A9 on cell proliferation of MCF-7 in different time(，n=3)

表1 GST-hS100A9作用不同時間對MCF-7增殖的影響(，n=3)Tab.1 The effects of GST-hS100A9 on cell proliferation of MCF-7 in different time(，n=3)

與空白組相比:1P＜0.05;與GST組相比:2P＜0.05Compared with control group:1P ＜0.05;Compared with GST group:2P ＜0.05

組 別A4501 d 2 d 3 d空白組0.991 ±0.096 2.060 ±0.086 2.710 ±0.076 GST 組 1.072 ±0.068 2.092 ±0.072 2.646 ±0.075 GST-hS100A9 組 0.990 ±0.048 1.889 ±0.0791，2 2.024 ±0.0561，2

本文選擇pGEX系列表達載體表達GST-hS100A9融合蛋白來研究其生物學功能和作用。該表達載體表達的融合蛋白既易于制備，純度較高，且保持有外源蛋白的生物學活性。我們通過基因重組技術將hS100A9基因插入融合表達載體pGST-moluc中構建了 pGST-hS100A9，經(jīng)過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，其所產(chǎn)生的兩個片段與限制性內(nèi)切酶圖譜相符，提示質粒構建成功。將質粒轉化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導表達融合蛋白GST-hS100A9。隨后利用谷胱甘肽偶聯(lián)球珠分離出融合蛋白，再經(jīng)含有還原型谷胱甘肽的洗脫緩沖液洗脫，離心后在上清中得到純化的融合蛋白。對純化的蛋白進行SDSPAGE和考馬斯亮藍染色以及Western blot鑒定，證實誘導表達的融合蛋白為GST-hS100A9，且純度達94%，與通常報道的一步親和色譜可分離純化純度90%以上蛋白一致;這也進一步證實了該融合蛋白質粒構建正確。BCA法測定誘導表達的菌液300 mL獲得了融合蛋白6 mg，產(chǎn)量高。且該蛋白可以抑制MCF-7細胞的增殖，與Li等[13]報道的結果相符，為我們進一步研究hS100A9的生物學功能及其作用機制提供了良好的條件。

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