楊慧珍，車 麗，任志強(qiáng)，肖建紅

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031）

雜草為害是造成玉米（Zeamays L.）減產(chǎn)的重要因素之一。植物基因工程技術(shù)的誕生和發(fā)展，為玉米抗除草劑育種提供了一條有效的途徑[1]。

李敬娜等[2]以pCambia3301載體為基礎(chǔ)，以玉米Ubiquitin（Ubi）啟動(dòng)子、擬南芥葉綠素轉(zhuǎn)運(yùn)肽（Chloroplast transit peptide，Ctp）基因、抗草甘膦Epsps基因?yàn)樵?，?gòu)建了玉米高效雙元表達(dá)載體，通過凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米幼胚，獲得了抗草甘膦無抗生素標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因玉米植株。馬云霞等[3]采用根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)法將抗草甘膦基因（sxglr-11）導(dǎo)入優(yōu)良玉米再生系HiII，獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株。關(guān)于抗草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米的研究，Sawahel[4]用電擊法將bar基因?qū)肓擞衩子着咧?，獲得了抗除草劑玉米材料。李國(guó)圣等[5]利用基因槍法將als基因?qū)肓擞衩子鷤M織中，獲得了轉(zhuǎn)基因玉米。朱常香等[6]利用基因槍法將bar基因?qū)肓擞衩鬃越幌档挠着咧校@得了抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米自交系。bar基因轉(zhuǎn)化水稻等[7]也獲得了抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株。bar基因（bialaphos resistance gene）編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin acetyltransferase，PAT），而PAT蛋白能使除草劑草丁膦（glufosinate）脫毒，從而使轉(zhuǎn)bar基因的作物具有抗除草劑的性狀[8]。

用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米已有不少報(bào)道，包括常規(guī)PCR檢測(cè)[9]、定性PCR檢測(cè)[10]、多重PCR檢測(cè)[11]和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)[12]等。

本研究通過不同植物總DNA的提取方法，對(duì)轉(zhuǎn)基因材料PCR分析時(shí)設(shè)置內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因，探討和分析其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及序列準(zhǔn)確性，建立一個(gè)快速、有效的轉(zhuǎn)基因玉米及其產(chǎn)品的檢測(cè)方法，旨在為有關(guān)研究提供一定的理論及技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

植物材料為花粉介導(dǎo)法導(dǎo)入bar基因（啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子）到玉米自交系黑玉2號(hào)所獲得的轉(zhuǎn)基因種子，它來自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心；非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩鬃越幌岛谟?號(hào)種子由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所提供。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

CaMV35S啟動(dòng)子引物序列、玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Zein引物序列和外源基因bar基因引物序列如表1所示。所用引物均由上海生工生物工程公司合成，用TE稀釋為100mmol/L。

表1 引物序列及擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度

1.3 總DNA提取

將玉米種子研磨成細(xì)粉，裝入2mL離心管中，用改良 PEX法、CTAB法[13]和 SDS法[14]分別提取總DNA。

改良PEX提取方法為：每管分別加入PEX提取液 （PEX 12.5mmol/L；Tris-Cl 100mmol/L；NaCl700mmol/L；EDTA 10mmol/L（pH 值 8.0）；PVP 6%）500μL，于65℃水浴中保溫20min；然后分別加入400μL Tris飽和酚，400μL氯仿/異戊醇（24∶1，V/V），輕輕顛倒混勻，冰浴放置5min，11 000 r/min離心10min；取上清液至另一2mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒混勻，冰浴放置5min，11 000 r/min離心10min；再取上清液至新的2mL離心管中，加入1/10體積的5mol/L乙酸鈉，混勻數(shù)分鐘后，加入9/10體積的冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30min，然后13 000 r/min離心12min；棄上清，加入200μL 70%乙醇，顛倒數(shù)次漂洗沉淀，13 000 r/min離心1min。同樣方法再用70%乙醇漂洗1次；待乙醇蒸發(fā)完后，加入40μL TE緩沖液，溶解DNA。

于0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取DNA的效果，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定DNA濃度，并用1×TE將總DNA稀釋至100 ng/μL備用。

陽性對(duì)照DNA按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[15]進(jìn)行。

1.4 PCR擴(kuò)增

建立PCR擴(kuò)增體系：體積20μL，10×緩沖液（含 Mg2+）2.0 μL，dNTPs（2.5mmol/L）1.6 μL，模板DNA 2.0μL，引物各0.8μL，Taq酶（5U/μL）0.4μL，用無菌去離子水定容至20μL。反應(yīng)在PT-100型PCR儀上進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，4℃保存。不同引物的退火溫度分別為：CaMV35S啟動(dòng)子55℃，Zein基因55℃，bar基因55℃。反應(yīng)結(jié)束后取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8μL，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（含溴化乙錠），用DL 2 000 DNA Marker為參照判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，用SYN凝膠成像系統(tǒng)照相。當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致時(shí)，用生工公司生產(chǎn)的回收試劑盒回收DNA，并送生工公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取DNA的純度和濃度

首先用SDS，CTAB和改良PEX 3種方法分別提取3份DNA樣品，所提取的DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，SYN成像系統(tǒng)觀察（圖1），發(fā)現(xiàn)這3種方法所提取DNA在凝膠上形成一條整齊的條帶，除CTAB法提取的DNA在前方有少量RNA污染物出現(xiàn)外，其他2種方法提取的DNA質(zhì)量都較高。

經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定，這3份DNA的質(zhì)量濃度達(dá)到 600～800μg/mL，OD260/OD280值在2.0左右，OD260/OD230值在1.6～1.8之間，均達(dá)到對(duì)DNA進(jìn)行分析的要求（表2）。但綜合這3種植物DNA提取方法，按一個(gè)流程計(jì)，PEX方法比SDS方法節(jié)省0.45 h，比CTAB方法節(jié)省2.0 h。

表2 提取DNA在核酸蛋白檢測(cè)儀上的測(cè)定結(jié)果

本著檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，本研究選用PEX法提取其余植物材料DNA，并做進(jìn)一步的PCR分析。

2.2 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測(cè)方法建立

用CaMV35S和bar引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果如圖2所示。不含模板DNA的空白對(duì)照無擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，說明PCR操作過程無污染。用Zein引物從轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因黑玉2號(hào)均擴(kuò)增出151 bp的產(chǎn)物，這與玉米中Zein片段的大小一致，說明從非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩缀娃D(zhuǎn)基因玉米中所提取的DNA能有效地進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用CaMV35S和bar引物擴(kuò)增時(shí)，產(chǎn)物與預(yù)期大?。?95，552 bp）相似，說明用這2對(duì)引物能從轉(zhuǎn)基因玉米中擴(kuò)增出目標(biāo)片段。

為了驗(yàn)證擴(kuò)增片段是否為目的基因，將用CaMV35S啟動(dòng)子和bar基因引物從轉(zhuǎn)基因植物中擴(kuò)增的片段分別回收測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用Blast進(jìn)行同源性分析。從擴(kuò)增片段與全長(zhǎng)bar基因極高的相似性可以看出，擴(kuò)增片段為CaMV35S啟動(dòng)子和bar基因，用這2對(duì)引物從轉(zhuǎn)基因植物中擴(kuò)增出了目標(biāo)基因，因此，可以用這2對(duì)引物鑒定抗草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米。

3 討論

關(guān)于植物基因工程，轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、非組培法[16]等，所獲得轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的快速檢測(cè)也有不少報(bào)道，主要是建立適合PCR分析的植物總DNA的快速提取方法[17]。

本研究采用3種方法分別提取植物總DNA，其中，改良PEX法每個(gè)流程比SDS法節(jié)省0.45 h，比CTAB法節(jié)省2.0 h，而且提取的DNA的濃度、純度測(cè)定結(jié)果顯示均可滿足PCR檢測(cè)分析及其他分子檢測(cè)的要求，且PCR檢測(cè)結(jié)果也符合預(yù)期目的。改良PEX提取DNA結(jié)合PCR檢測(cè)，無疑是一種快速、有效的轉(zhuǎn)基因玉米及其產(chǎn)品的檢測(cè)方法。

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