肖永學，劉 克

(1.膠南市靈山衛(wèi)中心衛(wèi)生院，山東 膠南 266427;2.青島市城陽區(qū)第二人民醫(yī)院，青島 266112)

目前，常用抗腫瘤藥多為化學合成的細胞毒類藥物，對正常細胞和癌細胞選擇性差，抑制骨髓造血系統(tǒng)，使白細胞數(shù)下降，導(dǎo)致腫瘤患者免疫力下降。?；撬?Tau)是一種含硫氨基酸，它對維持機體免疫系統(tǒng)的功能有非常重要的作用，是很好的免疫佐劑。本研究以S180荷瘤小鼠為模型，采用?；撬崤c環(huán)磷酰胺CTX聯(lián)合用藥，觀察?；撬釋Νh(huán)磷酰胺是否具有增效減毒作用。

1 實驗材料

1.1 動物 昆明種小鼠，體重(20±2)g，雌雄各半，由山東省青島市藥品檢驗所提供。

1.2 瘤株 小鼠肉瘤細胞株(S180)由中國協(xié)和醫(yī)科大學贈送，本室以腹水傳代保種。

1.3 試劑 脂多糖，Sigma公司;刀豆蛋白A，Sigma公司;PRMI－1640培養(yǎng)基，Gibco生物公司;?；撬?，天津市瑞金特化學品有限公司，批號:津Q/HX0016－2005;環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號:06043021;白細胞分離液，上海華精生物高科技有限公司，批號:060912。

1.4 儀器 離心機;恒溫水浴鍋;多功能顯微鏡(日本，O-lympus公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(德國赫利公司);酶標儀(美國BIO－RAD);無菌超凈臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有公司);電子分析天平(上海天平儀器總廠)。

2 實驗方法

2.1 藥物配制 ?；撬釣榘咨Y(jié)晶粉末，溶于水，實驗前用生理鹽水配制成所需濃度溶液;環(huán)磷酰胺實驗前用生理鹽水配制成所需濃度溶液。

2.2 S180荷瘤小鼠模型的建立［7～9］選擇本室腹水型傳代7～10 d且健康狀況良好的S180荷瘤小鼠，腹部皮膚用碘酊、酒精消毒后，抽取腹水，血細胞計數(shù)板上臺盼藍染色法證實活細胞率95%以上。以適量無菌生理鹽水稀釋成瘤細胞懸液，濃度為1×107個·mL－1。小鼠右腋窩皮下接種0.2mL(含瘤細胞2×106)S180細胞懸液。

2.3 動物分組及給藥 接種腫瘤后，將S180荷瘤小鼠隨機分為5組:模型組，CTX組，CTX+Tau低、中、高劑量組，每組10只。CTX組:給予CTX 20mg·kg－1;模型組:給予生理鹽水0.2mL;CTX+Tau低、中、高劑量組:分別給予 CTX 20mg·kg－1，Tau 50、100、200mg·kg－1。各組小鼠均于接種腫瘤 24 h后分別腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)8 d。常規(guī)飼養(yǎng)，飲水、食物不限。

2.4 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用各組小鼠均于接種腫瘤細胞24 h后分別腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)8 d，常規(guī)飼養(yǎng)，飲水、食物不限。第8天停止給藥和注射生理鹽水，24 h后，各組小鼠稱重，頸椎脫臼處死，剝?nèi)×鰤K，除去脂肪纖維組織稱重，按下列公式計算腫瘤抑制率(%):抑瘤率=(對照組平均瘤重－治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

2.5 牛磺酸與環(huán)磷酰胺合用對S180荷瘤小鼠外周血白細胞數(shù)［10］和骨髓有核細胞數(shù)的影響 給藥24 h后斷尾取血，進行白細胞計數(shù)。于小試管中加入白細胞稀釋液0.38mL，然后用血紅蛋白吸管自斷尾處取0.02mL血液，立即吹入稀釋液中，并將吸管壁的血吸入稀釋液內(nèi)，輕輕搖勻，用小滴管自搖勻的稀釋液中吸取少量液體加入血細胞計數(shù)池內(nèi)，靜置1～2min，在顯微鏡下觀察并計算白細胞總數(shù)。在低倍鏡下，白細胞呈圓形，漿透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特點可與雜質(zhì)相區(qū)別。計數(shù)計數(shù)池四角的4個大方格中所有的白細胞數(shù)，將總數(shù)乘以50，即得每毫升血中白細胞數(shù)。小鼠頸椎脫臼處死，剝離右側(cè)股骨，用1640培養(yǎng)液通過針頭反復(fù)沖洗骨髓并測定洗液中骨髓有核細胞數(shù)。

2.6 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對S180荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響 末次給藥24 h后頸椎脫臼處死小鼠，無菌取胸腺和脾，用電子分析天平分別稱重。根據(jù)以下公式計算胸腺指數(shù)、脾指數(shù):胸腺指數(shù)(thymus index，TI)=胸腺重(g)/體重(g);脾臟指數(shù)(spleen index，PI)=脾重(g)/體重(g)。

2.7 S180荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性測定和淋巴細胞增殖活性測定

2.7.1 S180荷瘤小鼠脾細胞懸液制備 無菌摘除脾臟，剔除結(jié)締組織，PBS沖洗1次，200目不銹鋼篩網(wǎng)上，把脾臟用研缽碾碎，篩網(wǎng)下置安剖，用PBS反復(fù)沖洗于高壓滅菌安瓿中。所得混入脾細胞的液體加入到含有白細胞分離液的離心管中，離心，得到脾細胞懸液。反復(fù)沖洗數(shù)次，制成單個脾淋巴細胞懸液。臺盼藍染色計數(shù)，活細胞95%以上，調(diào)整濃度5×106個·mL－1。

2.7.2 S180荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性測定 MTT比色法。取脾細胞懸液，濃度為5×106個·L－1，作為效應(yīng)細胞(E)。制備常規(guī)培養(yǎng)S180細胞懸液(活性＞95%)，濃度為1×105個·L－1，作為靶細胞(T)。效靶細胞濃度比為50∶1。每只鼠設(shè)靶細胞孔(T)，效應(yīng)細胞孔(E)，效應(yīng)細胞+靶細胞實驗孔(E+T)，另設(shè)空白對照孔。按表1加樣于96孔圓底培養(yǎng)板，每孔終體積200μL。每樣本設(shè)3個復(fù)孔。將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱，37℃ 5%CO2飽和濕度條件下孵育24 h后，各孔加入MTT溶液(5mg·mL－1)20μL同樣條件繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。然后吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO。吹打均勻，于酶標儀490 nm處測定OD值。計算方法:NK細胞活性(%)=［靶細胞對照孔OD值－(實驗孔OD值－效應(yīng)細胞對照孔OD值)］/靶細胞對照孔OD值×100%。加樣見表1。

2.7.3 S180荷瘤小鼠T淋巴細胞增殖活性測定 取脾細胞懸液，濃度為5×106個·L－1，ConA溶液濃度調(diào)整為5mg·L－1。每只鼠設(shè):ConA實驗孔，空白對照孔。按表2加樣于96孔平底培養(yǎng)板，每孔終體積200μL。每樣本設(shè)3個復(fù)孔。將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱孵育72 h后，加入MTT溶液(5mg·mL－1)20μL，同樣條件繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。然后棄上清液，每孔加入150μL DMSO。吹打均于酶標儀570 nm波長處測定OD值，計算淋巴細胞增殖率。淋巴細胞增殖率(%)=［(實驗孔OD值－對照孔OD值)/對照孔OD值］×100%。加樣見表2。

表1 測定NK細胞活性各組加樣情況

表2 測定T淋巴細胞增殖活性測定各組加樣情況

S180荷瘤小鼠B淋巴細胞增殖活性測定:方法同T淋巴細胞，絲裂原為 20mg·L－1的 LPS。

3 實驗結(jié)果

3.1 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用與模型組比較，CTX組與Tau+CTX各劑量組都具有顯著的腫瘤抑制作用。并且Tau+CTX低、中、高劑量組抑瘤率均高于CTX組，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。說明Tau可以協(xié)同CTX發(fā)揮抑制腫瘤的作用，結(jié)果見表3。

3.2 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對S180荷瘤小鼠外周血白細胞數(shù)和骨髓有核細胞數(shù)的影響:CTX組外周血白細胞數(shù)量與模型對照組比較顯著降低，CTX+Tau中、高劑量組外周血白細胞數(shù)量與CTX組比較，明顯升高;CTX組骨髓有核細胞數(shù)量與模型對照組比較顯著降低，CTX+Tau中、高劑量組骨髓有核細胞數(shù)量與CTX組比較，明顯升高。說明Tau可以減輕CTX抑制荷瘤小鼠骨髓的毒性，提高荷瘤小鼠CTX化療后外周血白細胞數(shù)，結(jié)果見表4。

表3 Tau與CTX合用對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

表4 Tau與CTX合用對S180荷瘤小鼠外周血白細胞數(shù)和骨髓有核細胞數(shù)的影響

3.3 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對S180荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影 與模型組比較，CTX組荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(P＜0.05);而CTX+Tau各劑量組高于CTX組(P＜0.05)，尤其是CTX+Tau高劑量組(P ＜0.01)，說明CTX對S180荷瘤小鼠的免疫器官具有免疫毒性，而Tau可以抑制CTX的這種作用，并且呈劑量依賴性。說明牛磺酸可以促進荷瘤小鼠脾臟和胸腺的生長，改善CTX對荷瘤小鼠免疫器官的毒性作用，結(jié)果見表5。

3.4 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對S180荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性的影響 CTX組NK細胞活性與模型組比較，兩者之間沒有差異，但是CTX+Tau高劑量組NK細胞活性與CTX組比較，明顯升高，差異有顯著性，結(jié)果見表6。

3.5 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對S180荷瘤小鼠淋巴細胞增殖活性的影響 與模型組比較，CTX組T、B淋巴細胞增殖沒有明顯差別;與CTX組比較，CTX+Tau低、中、高劑量組T淋巴細胞增殖活性升高，并且低、中、高劑量組B淋巴細胞增殖活性均上升，結(jié)果見表7。

表5 Tau與CTX合用對S180荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響

4 結(jié)論

本研究采用S180小鼠移植瘤模型，以化療藥物CTX作陽性對照組，觀察Tau對CTX的增效減毒作用。通過本實驗得到如下結(jié)論:

表6 Tau與CTX合用對S180荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性的影響

表7 Tau與CTX合用對S180荷瘤小鼠淋巴細胞增殖活性的影響

①Tau合用CTX，對S180荷瘤小鼠抑瘤率明顯高于單一使用CTX，Tau與CTX合用對腫瘤具有協(xié)同抑制作用;②Tau改善了CTX對S180荷瘤小鼠骨髓的抑制作用，Tau與CTX合用可明顯升高外周血白細胞數(shù)和骨髓有核細胞數(shù);③Tau可以減輕CTX對S180荷瘤小鼠免疫器官的毒性作用，保護S180荷瘤小鼠脾臟和胸腺并促進其生長;④Tau與CTX合用可以增強S180荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性;⑤Tau與CTX合用可以增強S180荷瘤小鼠的淋巴細胞增殖率。

綜上所述，Tau與CTX合用對腫瘤具有協(xié)同抑制作用，改善CTX對小鼠骨髓的抑制作用，緩解CTX對機體的免疫毒性作用，即Tau對CTX具有增效減毒作用。

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