蔣愛(ài)鳳,胡喜巧,李蘭

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003）

中性蛋白酶作用條件溫和,是最早發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑[1],可應(yīng)用于食品、制藥、化妝品以及絲紡等行業(yè)[2].其中,在食品中可用于餅干、面包、面條的生產(chǎn)與加工、酒類發(fā)酵、啤酒、果汁飲料澄清、醬油的釀制等,也可用來(lái)水解各種蛋白質(zhì)以獲得多肽或氨基酸.中性蛋白酶生產(chǎn)既可以從動(dòng)植物組織中提取,也可以通過(guò)微生物發(fā)酵工藝進(jìn)行生產(chǎn),將植物作為蛋白酶的來(lái)源會(huì)受到一些諸如氣候條件,以及可利用土地面積的大小等因素的影響,并且從植物中提取蛋白酶是一個(gè)極其耗時(shí)的過(guò)程,而以動(dòng)物作為蛋白酶的來(lái)源,其產(chǎn)量的大小主要依賴于可被屠宰牲畜的數(shù)量.由于從植物和動(dòng)物中生產(chǎn)蛋白酶具有局限性,人們?cè)絹?lái)越多地把目光投到微生物蛋白酶上,微生物由于生長(zhǎng)速度快、所需空間狹小、廣泛的生化多樣性及其遺傳可操作性等特點(diǎn),因而備受人們青睞.據(jù)統(tǒng)計(jì),微生物蛋白酶占據(jù)了世界整個(gè)酶銷售市場(chǎng)約40%的份額,已成為市場(chǎng)上蛋白酶生產(chǎn)的主要來(lái)源.

米曲霉Aspergillus oryzae是美國(guó)食品藥物管理局（FDA）公布的40余種安全微生物菌種之一[3],米曲霉的酶包括蛋白酶、淀粉酶、肽酶、谷氨酰氨酶、脂肪酶、果膠酶、轉(zhuǎn)化酶、纖維素酶及麥芽糖酶等酸、中、堿性酶,其中起關(guān)鍵作用的是蛋白酶.張淑娟[4]、Padmanabhan[5]、Fushimi[6]等對(duì)米曲霉中性蛋白酶部分特性進(jìn)行了研究,但仍未見(jiàn)系統(tǒng)的研究文獻(xiàn),尤其是在酶的提取方法方面.

從釀造白酒的大曲中分離純化得到米曲霉菌種,系統(tǒng)地研究了該酶的提取方法以及溫度、鹽度、pH、乙二胺四乙酸（EDTA）等對(duì)米曲霉中性蛋白酶活力的影響,并研究得出該酶的米氏常數(shù)Km及其最大反應(yīng)速率Vmax,以期能夠?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)提供理論參考依據(jù).

1 材料和方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

米曲霉：河南某白酒廠白酒大曲中分離純化得到.培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基[7].

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑 除酪蛋白（浙江富陽(yáng)杭富生物制品廠）為生化試劑外,其他藥品均為分析純?cè)噭?麥麩、黃豆粉為市購(gòu).

1.2.2 儀器 YXQG02型手提式滅菌鍋（山東安得醫(yī)療科技有限公司）,BCM-1000型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）,HH-SYZ1-NI型數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）,722型分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）.

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 米曲霉菌種分離 將白酒大曲研磨成粉狀,制成菌懸液,并對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋,并涂布平板,30℃培養(yǎng)5 d,根據(jù)菌落的生物學(xué)特征,篩選出目的菌株米曲霉.將米曲霉挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)5 d,斜面長(zhǎng)好后放入冰箱保存待用.

1.3.2 固體培養(yǎng) 在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中接3環(huán)斜面菌種于三角瓶麩皮豆粕固體培養(yǎng)基中,充分搖勻.于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并分別于24 h和48 h各扣瓶,共培養(yǎng)72 h.

1.4 分析方法

1.4.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取試管編號(hào)按照表1配置各種不同濃度的酪氨酸溶液,后分別吸取不同濃度的酪氨酸1mL于相應(yīng)試管中,再各加入0.4mol的Na2CO3溶液5mL,加入已稀釋3倍的Folin-酚試劑1mL.搖勻后置于水浴鍋中,40℃保溫反應(yīng)20min,用722型分光光度計(jì)在660 nm下進(jìn)行測(cè)定.試驗(yàn)做3次重復(fù),用蒸餾水做空白對(duì)照.所測(cè)得的光密度為凈OD值.以凈OD值為橫坐標(biāo),酪氨酸的濃度為縱坐標(biāo),繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1.

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 配制各種不同濃度的酪氨酸溶液試劑

1.4.2 中性蛋白酶活力測(cè)定：Folin-酚法[8]

1.4.3 粗酶液的制備 將發(fā)酵好的培養(yǎng)物于40℃恒溫箱中烘干,并用研缽研磨成細(xì)粉.稱取固體樣品各5 g于3個(gè)燒杯中,然后分別向3個(gè)燒杯中各加入100mL生理鹽水、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液、蒸餾水.分別用玻璃棒攪拌均勻,置30℃恒溫水浴鍋中浸取30min,每10min攪動(dòng)1次,用低速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速為4000 r/min）離心20min取上清,即為粗酶液[9]。

1.4.4 粗酶的硫酸銨沉淀提取 設(shè)置不同濃度梯度的硫酸銨溶液,對(duì)所分離的粗酶液進(jìn)行作用,通過(guò)測(cè)定酶活力來(lái)確定硫酸銨沉降中性蛋白酶的濃度[10].

1.4.5 酶學(xué)性質(zhì)研究 設(shè)置不同的溫度梯度、作用時(shí)間梯度、pH梯度、氯化鈉濃度梯度、EDTA濃度梯度對(duì)粗酶液進(jìn)行反應(yīng),通過(guò)測(cè)定酶活力,對(duì)酶的最適作用溫度、酶的熱穩(wěn)定性、最適作用pH值及pH值穩(wěn)定性、中性蛋白酶的耐鹽性、EDTA對(duì)酶活性的影響進(jìn)行研究.并對(duì)蛋白酶的米氏常數(shù)（Km）進(jìn)行確定.

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)酶活力的影響

將用3種不同溶液提取方法得到的粗酶液,再用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液適當(dāng)稀釋,稀釋倍數(shù)為0、2、4、6倍,每個(gè)稀釋倍數(shù)做3次重復(fù),分別測(cè)酶活力,以確定該中性蛋白酶的最佳提取方法.結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 不同提取方法測(cè)得的單位酶活力

從表2可見(jiàn),在3種提取方法及各個(gè)稀釋倍數(shù)中,用生理鹽水提取測(cè)得的單位酶活力值最大,故效果最好,pH7.2緩沖溶液提取效果次之,蒸餾水提取的效果最差.本試驗(yàn)也說(shuō)明了稀釋2倍時(shí)提取效果較穩(wěn)定.故選擇用生理鹽水并稀釋2倍作為制取粗酶液的方法.

2.2 硫酸銨沉淀蛋白酶最適濃度的選擇

取25mL刻度試管分別稱入0、1.40 g、2.85 g、4.40 g、6.07 g、7.83 g、9.75 g、11.80 g、14.03 g、16.55 g的硫酸銨用浸提后未稀釋的粗酶液定容至25mL,配制成0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的硫酸銨溶液,置于4℃冰箱中過(guò)夜.4000 r/min離心10min去除固形物.分別取上清液測(cè)定各個(gè)試管中殘余中性蛋白酶酶活力,以確定硫酸銨沉降中性蛋白酶的濃度.以未加硫酸銨處理的酶活力為100%作為對(duì)照,計(jì)算相對(duì)酶活力.以硫酸銨濃度為橫坐標(biāo),以相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖2.

從圖2可以看出,粗酶液中殘余的中性蛋白酶相對(duì)酶活力隨著硫酸銨飽和度的提高而減小,故隨著硫酸銨濃度的增加,中性蛋白酶的提取效果越好.由圖顯示：沉淀中性蛋白酶的硫酸銨濃度應(yīng)為80%.

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 酶的最適作用溫度及酶的熱穩(wěn)定性

圖2 硫酸銨濃度對(duì)蛋白酶沉淀的影響

2.3.1.1 酶的最適作用溫度 將用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋好的粗酶液分別在35℃、40℃、45℃、50℃ 、55℃ 、60℃ 、65℃ 、70℃的條件下與1%酪素底物反應(yīng)10min,其余條件相同,測(cè)定中性蛋白酶酶活力.以55℃處理下的酶活力為100%作為對(duì)照,計(jì)算相對(duì)酶活力.以相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo),酶的作用溫度為橫坐標(biāo)作圖3.

從圖3可以看出：55℃時(shí)相對(duì)酶活力達(dá)到最大,60℃酶活力開(kāi)始下降.因此,米曲霉中產(chǎn)中性蛋白酶作用的最適溫度為55℃.2.3.1.2酶的熱穩(wěn)定性 取用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋好的粗酶液于40℃、50℃、60℃恒溫條件下分別保溫 0min、20min、40min、60min、80min、100min 后立即冰浴,根據(jù) Folin- 酚法,測(cè)定中性蛋白酶酶活力.以處理時(shí)間為0min的酶活力為100%作為對(duì)照,計(jì)算相對(duì)酶活力.以相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo),酶作用時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖4.

圖3 酶的最適作用溫度

圖4 酶的熱穩(wěn)定性

從圖4可以看出,40℃的酶活力相對(duì)穩(wěn)定,處理80min時(shí),相對(duì)酶活力仍保持了62.15%,但當(dāng)處理到100min時(shí),酶活力迅速下降,說(shuō)明在保溫80min以后,酶蛋白開(kāi)始迅速變性.50℃下處理60min只保持了相對(duì)酶活力的41.5%,處理到80min時(shí),粗酶中幾乎檢測(cè)不到酶活力,60℃下處理20min時(shí)相對(duì)酶活力只有3.62%.這說(shuō)明該中性蛋白酶不耐高溫處理.

2.3.2 酶的最適作用pH值及酶的pH值穩(wěn)定性將酶液分別用 pH 值分別為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.1mol/L磷酸緩沖溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,然后用相應(yīng)pH緩沖溶液配置干酪素,根據(jù)Folin-酚法,測(cè)定中性蛋白酶酶的活力.以pH為7.0的酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力.以相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo),pH為橫坐標(biāo)作圖5.

圖5 pH對(duì)酶活力的影響

由圖5的結(jié)果,可以看出：在pH為7.0時(shí)相對(duì)酶活力達(dá)到最大.酶的pH穩(wěn)定性反應(yīng)了酶的耐酸堿能力.從圖 5 可知,在 pH 6.0～8.0 范圍,該中性蛋白酶穩(wěn)定性較好,特別在中性偏酸范圍該酶可以保持85.56%以上的相對(duì)酶活力.

2.3.3 中性蛋白酶的耐鹽性 將酶液用氯化鈉分別調(diào)至濃度為 4%、8%、12%、16%、20%、24%于40℃保溫1 h后,每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù).根據(jù)Folin-酚法,測(cè)定中性蛋白酶活力.以NaCl濃度為0%的酶活力為100%作為對(duì)照,計(jì)算相對(duì)酶活力.以相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo),以NaCl濃度為橫坐標(biāo),可得圖6.

從圖6可見(jiàn),NaCl對(duì)中性蛋白酶活力有抑制作用,并隨著鹽度的增高,蛋白酶的相對(duì)酶活力逐漸下降,但鹽度為24%時(shí),相對(duì)酶活力仍有58.82%.所以,我們?cè)谑称丰勚七^(guò)程中可以采取分批加入食鹽的方法,以使中性蛋白酶的活性不致下降得過(guò)快.

2.3.4 EDTA對(duì)酶活性的影響 將浸提好的粗酶液用不同濃度的EDTA稀釋2倍制成粗酶液,EDTA的濃度在分別為0mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L 、1 mmol/L、2 mmol/L 、5 mmol/L和10mmol/L,每一個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù).根據(jù)Folin-酚法,測(cè)定中性蛋白酶活力.以不加EDTA的酶活力為100%作為對(duì)照,計(jì)算相對(duì)酶活力.以相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo),EDTA濃度為橫坐標(biāo),結(jié)果見(jiàn)圖7.

從圖7可以看出,EDTA對(duì)酶活力有一定得影響,并隨著EDTA濃度的升高,相對(duì)酶活力不斷下降.但EDTA的濃度大于5.0 mmol/L后,其變化引起的相對(duì)酶活力下降變小.因此,可以推斷其中性蛋白酶應(yīng)具有2種或2種以上的,且其中一種為金屬蛋白酶.Fushimi[6]等研究也表明米曲霉中性蛋白酶有2種,其中中性蛋白酶Ⅱ?yàn)楹琙n2﹢離子金屬蛋白酶.

2.3.5 米氏常數(shù)的測(cè)定 以2%的酪素溶液為母液分別配制 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的系列標(biāo)準(zhǔn)液各10mL.以酪素為底物,在40℃水浴中,測(cè)定不同底物濃度下的酶促反應(yīng)速率,以S/V-S作圖8[11].

由圖8可見(jiàn),該直線方程為y=0.1789x+0.2649,橫軸的截距為-Km,斜率為1/Vmax.故結(jié)果表明以酪素為底物時(shí),Km值1.51mg/mL,最大反應(yīng)速率Vmax=5.59mg/min.

圖6 NaCl濃度對(duì)酶活力的影響

圖7 EDTA對(duì)酶活力的影響

圖8 以Hanes Woolf法作S/V與S的關(guān)系

3 結(jié)論

（1）米曲霉中性蛋白酶的最佳提取方法為加入生理鹽水（發(fā)酵干曲：生理鹽水＝1：20）,攪拌均勻,置恒溫（30℃）培養(yǎng)箱中提取30min,每10min攪拌1次,最后用4層紗布過(guò)濾.

（2）硫酸銨沉降中性蛋白酶的最佳濃度為80%.該中性蛋白酶的最適作用溫度為55℃,最適pH值為7.0,該酶在40℃下的穩(wěn)定性較好,50℃處理80min和60℃下處理20min,幾乎檢測(cè)不到酶活力；該中性蛋白酶pH穩(wěn)定范圍為6.0～8.0.

（3）NaCl和EDTA對(duì)中性蛋白酶活力具有抑制作用,隨著NaCl和EDTA濃度的增高,蛋白酶的活力都逐漸下降,當(dāng)鹽度為24%時(shí),相對(duì)酶活力仍有58.82%；但EDTA的濃度大于5.0mmol/L后,其變化引起的相對(duì)酶活力下降變小.因此,可以推斷其中性蛋白酶應(yīng)具有2種或2種以上的,且其中一種為金屬蛋白酶.

（4）動(dòng)力學(xué)研究表明：以酪素為底物,米氏常數(shù)值為1.51mg/mL,最大反應(yīng)速率Vmax為5.59mg/min.通過(guò)以上研究可以得知,中性蛋白酶是一種生物活性物質(zhì),易受氧化劑的抑制及破壞作用,在貯存或使用過(guò)程中應(yīng)避免與之接觸.米曲霉所產(chǎn)的中性蛋白酶是一種具有前景的飼用酶制劑,可用于食品的加工；對(duì)于白酒釀制行業(yè),具有節(jié)約糧食,出酒率高,機(jī)械化生產(chǎn)周期短等深遠(yuǎn)意義.

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