包永霞，李 雪，滿 達，韓烈保,4

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京 100083；2.北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，北京 100083；3.北京林業(yè)大學(xué)總務(wù)與產(chǎn)業(yè)管理處，北京 100083；4.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

鹽害是21世紀(jì)世界農(nóng)業(yè)面臨的重要問題[1]。水資源短缺和土地鹽漬化是限制植物生長的重要因子，土壤次生鹽化問題已經(jīng)成為影響我國北方地區(qū)禾草使用價值的重要限制因素[2]。充分開發(fā)利用鹽化土壤，種植經(jīng)濟價值較高的耐鹽植物是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的重大課題[3]。為了解決以上問題，通過基因工程手段選育耐鹽堿草坪草新品種，改良和利用鹽化土壤具有廣闊的發(fā)展前景。

DREB是一類參與應(yīng)答植物非生物脅迫的主要調(diào)控蛋白，植物在低溫、高鹽及干旱逆境脅迫下，DREB基因被誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物與DRE特異結(jié)合，啟動下游與抗逆性相關(guān)的功能基因的表達，基因產(chǎn)物累積，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)，最終使植物的抗逆性得到提高[4]。多年生黑麥草(Loliumperenne)是一種應(yīng)用廣泛的冷季型草坪草，但對于干旱的耐受力較弱，對鹽的耐受力中等。本研究主要分析轉(zhuǎn)DREB1A基因的多年生黑麥草T1代萌發(fā)期對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl溶液的抗性，以期篩選耐鹽轉(zhuǎn)基因植株以及耐鹽指標(biāo)，為鹽害地區(qū)土壤的利用和改良提供新的植物資源和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1供試材料 通過建立多年生黑麥草(愛神特品種)高頻再生體系，應(yīng)用基因槍轉(zhuǎn)化法將DREB1A基因?qū)肱咝杂鷤M織，獲得了轉(zhuǎn)基因植株；通過自由雜交方式獲得轉(zhuǎn)基因T1代[5]。轉(zhuǎn)基因親本植株的抗旱性初步研究結(jié)果證明，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性比非轉(zhuǎn)化植株有明顯提高[5-6]。

本研究供試材料分別為DREB1A7株系互為父母本雜交得到的T1代種子(DREB1A7)；DREB1A27株系互為父母本雜交得到的T1代種子(DREB1A27)；DREB1A82株系互為父母本雜交得到的T1代種子(DREB1A82)；多年生黑麥草非轉(zhuǎn)化植株子一代種子(CK)作對照。

1.2方法 將雙層濾紙鋪在直徑為9.0 cm的培養(yǎng)皿中作發(fā)芽床，每皿均勻擺放50粒成熟飽滿、大小均勻的種子，分別用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%)的化學(xué)純 NaCl 鹽溶液進行處理。置于光照培養(yǎng)箱中變溫培養(yǎng)(25 ℃ 16 h/16 ℃ 8 h)。每日定量補水，保持發(fā)芽床濕潤，種子萌發(fā)以胚根伸出種皮0.2 cm作為發(fā)芽標(biāo)志[7]，記錄萌發(fā)種子數(shù)，共記錄20 d。每處理3次重復(fù)。

1.2.1相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率 第7天萌發(fā)數(shù)占供試種子數(shù)的百分比為相對發(fā)芽勢；第10天萌發(fā)數(shù)占供試種子數(shù)的百分比為相對發(fā)芽率[5]。

1.2.2胚芽長和胚根長 第20天用直尺測量萌發(fā)后幼苗葉片、根系絕對長度。

1.2.3細胞膜透性 第20天取新鮮葉片0.1 g，剪碎置于具塞刻度試管中，加10 mL無離子水，在BS-2F恒溫振蕩培養(yǎng)箱(箱內(nèi)溫度25 ℃，400 r/min)振蕩4 h后，用DJS-11A電導(dǎo)儀測其電導(dǎo)率Rc0，然后置于沸水中5 min，待冷卻后測其電導(dǎo)率Rc1，最后計算其相對電導(dǎo)率[8]。

1.2.4葉綠素含量 參照李合生等[9]的方法測定葉綠素含量。

1.2.5葉片含水量和葉片相對含水量 采用組織烘干法[10]，稱取葉片鮮質(zhì)量(mf)，然后將葉片放入干燥箱中80 ℃下烘48 h，稱干質(zhì)量(md)。

葉片含水量=(mf-md)/mf×100%。

參照華東師大植物生理教研室[11]的方法測定葉片相對含水量(RWC)。

1.2.6數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫對種子相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率的影響 相對發(fā)芽勢隨鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降。0.3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，各材料的相對發(fā)芽勢均開始不同程度地下降。對照組變化幅度大，與轉(zhuǎn)基因組的差異顯著，0.6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下DREB1A82表現(xiàn)出較強抗性；DREB1A7和DREB1A27相對發(fā)芽勢下降程度居中；CK的相對發(fā)芽勢下降到6%。0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下只有DREB1A82表現(xiàn)出好的抗性，DREB1A7和DREB1A27相對發(fā)芽勢不到4%，CK的相對發(fā)芽勢下降到0。1.2%～1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)時所有材料相對發(fā)芽勢均下降到0(圖1)。

0.3%～0.6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，各材料的相對發(fā)芽率均開始不同程度地下降，其中對照組下降程度明顯。0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下DREB1A82和DREB1A27表現(xiàn)出良好抗性；DREB1A7相對發(fā)芽率下降程度居中；CK的相對發(fā)芽率下降到0。但是，1.2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下DREB1A7仍表現(xiàn)出好的抗性，DREB1A82和DREB1A27相對發(fā)芽率驟降至4%。DREB1A7對1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫有較強的抗性；DREB1A27在1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下仍有8%的相對發(fā)芽率(圖2)。

圖1 鹽脅迫對轉(zhuǎn)DREB1A基因多年生黑麥草T1代與非轉(zhuǎn)化植株子一代相對發(fā)芽勢的影響

圖2 鹽脅迫對轉(zhuǎn)DREB1A基因多年生黑麥草T1代與非轉(zhuǎn)化植株子一代相對發(fā)芽率的影響

2.2鹽脅迫對胚芽長、胚根長的影響 隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加供試材料胚芽長整體上呈逐漸降低趨勢，轉(zhuǎn)基因組在0～0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下下降程度不明顯，對照組在0.6%～0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下胚芽長下降程度與轉(zhuǎn)基因組存在極顯著差異。1.2%～1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，除DREBIA82外，轉(zhuǎn)基因組表現(xiàn)良好抗性，對照組的胚芽長均為0(圖3)。

所有供試材料在0～0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下胚根長受抑制程度不明顯，對照組胚根長對鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)有良好抗性，甚至比轉(zhuǎn)基因植株抗鹽。1.2%～1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下轉(zhuǎn)基因組和對照組均沒有長出胚根(圖4)。

2.3鹽脅迫對細胞膜透性的影響 各材料細胞膜透性與鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比，轉(zhuǎn)基因組和對照組細胞膜透性增大的程度不同，對照組在0.6%～1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫下的細胞膜透性始終比轉(zhuǎn)基因組高(圖5)。

圖3 鹽脅迫對轉(zhuǎn)DREB1A基因多年生黑麥草T1代與非轉(zhuǎn)化植株子一代胚芽長的影響

圖4 鹽脅迫對轉(zhuǎn)DREB1A基因多年生黑麥草T1代與非轉(zhuǎn)化植株子一代胚根長的影響

圖5 鹽脅迫對轉(zhuǎn)DREB1A基因多年生黑麥草T1代與非轉(zhuǎn)化植株子一代細胞膜透性的影響

2.4鹽脅迫對葉片葉綠素含量的影響 隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加葉片葉綠素含量整體上呈逐漸降低趨勢，轉(zhuǎn)基因組隨鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)遞增，緩慢下降。1.2%～1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下轉(zhuǎn)基因組仍具有較高含量的葉綠素。對照組在0～0.6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下葉綠素含量下降幅度與轉(zhuǎn)基因組基本一致。0.9%～1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下大幅度下降，與轉(zhuǎn)基因組的下降幅度呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)(圖6)。

2.5鹽脅迫對葉片含水量和相對含水量的影響 葉片含水量在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)時變化不明顯，但在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)時隨著鹽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加呈現(xiàn)出下降趨勢，對照組在0.6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下開始有明顯下降，在0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下驟降為0。轉(zhuǎn)基因組在0～0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下均沒有明顯變化，1.2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下驟降至0(圖7)。

轉(zhuǎn)基因組的葉片相對含水量在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)時逐漸上升，但變化程度不明顯，在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1.2%)時呈明顯下降趨勢。對照組在0.6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下開始有明顯下降，在0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)時下降為0(圖8)。

圖6 鹽脅迫對轉(zhuǎn)DREB1A基因多年生黑麥草T1代與非轉(zhuǎn)化植株子一代葉片葉綠素含量的影響

圖7 鹽脅迫對轉(zhuǎn)DREB1A基因多年生黑麥草T1代與非轉(zhuǎn)化植株子一代葉片含水量的影響

圖8 鹽脅迫對轉(zhuǎn)DREB1A基因多年生黑麥草T1代與非轉(zhuǎn)化植株子一代葉片相對含水量的影響

3 討論

鹽分在植物的各個時期都有危害[12]。鹽逆境降低草坪草種子的發(fā)芽率，使萌發(fā)延遲[13]。本研究結(jié)果表明，相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率均隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加而下降，表明鹽溶液對種子萌發(fā)有一定抑制作用。但是，轉(zhuǎn)基因組在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫下仍具有較高的發(fā)芽率，而對照組只有在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫下有部分種子萌發(fā)。鹽逆境還會抑制幼苗生長[13]，抑制植物組織和器官的生長和分化。鹽脅迫對對照組的胚芽長有嚴(yán)重抑制作用；轉(zhuǎn)基因組表現(xiàn)良好的抗性，其胚芽長受抑制程度較低。低質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫對胚根長的抑制不明顯，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫下幾乎所有材料均無胚根長出。轉(zhuǎn)基因組和對照組的胚根長在各質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫下無明顯差異和變化規(guī)律。

鹽脅迫下植株體內(nèi)的葉綠素酶活性增強，促進葉綠素b的降解，使得植株葉片的葉綠素含量降低[14]。隨鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)遞增，葉綠素含量呈降低趨勢。轉(zhuǎn)基因組在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽脅迫下仍具有較高含量的葉綠素，呈良好抗性。除此之外，抗逆境還會使細胞內(nèi)自由基引發(fā)膜脂過氧化，造成細胞膜系統(tǒng)的損傷，膜透性增加[15]。本研究證明，轉(zhuǎn)基因組在鹽脅迫下膜的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，透性變化較小，受到傷害較輕，因而抗鹽性比對照組強。

4 結(jié)論

1) 相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、胚芽長、細胞膜透性、葉片葉綠素含量、葉片含水量和相對含水量都可作為轉(zhuǎn)DREB1A基因多年生黑麥草T1代耐鹽植株篩選的參考指標(biāo)。

2) 除胚根長以外的所有指標(biāo)在0.9%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，轉(zhuǎn)基因組和對照組之間的差異均達到顯著水平(P<0.05)。所以，0.9%的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)可作為轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草T1代耐鹽種子篩選的參考質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3) 轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫有較強的抗性，對高質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.9%～1.5%)鹽脅迫也有一定抗性，與對照組相比有顯著性差異。轉(zhuǎn)DREB1A基因多年生黑麥草T1代種子可作為鹽害地區(qū)改良與利用的植物新資源。

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