朱中南 鄭 毅 章淑妹 朱志春

α-淀粉酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

朱中南 鄭 毅*章淑妹 朱志春

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

利用米曲霉菌株液體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶。產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)表明：以面粉為碳源，黃豆餅粉為有機(jī)氮源，NaNO3為無(wú)機(jī)氮源。發(fā)酵配方如下（g/L）：面粉濃度為45，黃豆餅粉濃度為20，NaNO34，K2HPO43，MgSO41，F(xiàn)eSO4?7H20 0.01。產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化表明：最適發(fā)酵初始pH為7，裝液量為40mL（250mL三角瓶），接種量為10%，發(fā)酵溫度為33.5℃，搖床轉(zhuǎn)速為235rpm，培養(yǎng)時(shí)間為72h。此條件下，最終發(fā)酵水平達(dá)到1962.32U/mL，比初始時(shí)提高45%。

米曲霉 α-淀粉酶 單因素實(shí)驗(yàn)

α- 淀粉酶（α-1，4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶）普遍分布在動(dòng)物、植物和微生物中，是一種重要的淀粉水解酶[1]。它以隨機(jī)作用方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的α-1，4葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的酶制劑之一，主要應(yīng)用于發(fā)酵、紡織、飼料、醫(yī)藥等多種領(lǐng)域[2]。應(yīng)用于各種工業(yè)中對(duì)縮短生產(chǎn)周期、提高產(chǎn)品得率和原料的利用率，提高產(chǎn)品質(zhì)量和節(jié)約糧食資源，都有著極其重要的作用。

目前本實(shí)驗(yàn)室的米曲霉是采用誘變?nèi)诤系玫?，其發(fā)酵的初始培養(yǎng)基的配方，所產(chǎn)淀粉酶的量還不是很高，通過(guò)培養(yǎng)基的優(yōu)化可以提高酶的產(chǎn)量，同時(shí)可以采用更為低廉的天然農(nóng)產(chǎn)品或工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄品來(lái)替代價(jià)格較為昂貴的藥品、材料，以降低成本。本實(shí)驗(yàn)采用單因素法確定米曲霉最適的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、pH值、溫度、接種量、裝液量等，從而得出最優(yōu)的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌種

米曲霉()FS0113,本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 30，NaNO32, K2HPO41, MgSO40.05, KCl 0.5,麩皮 0.8，瓊脂 1.2，F(xiàn)eSO4?7H20 0.01。

2）種子培養(yǎng)基（g/L)：NaNO34，K2HPO43，MgSO41，F(xiàn)eSO4?7H20 0.01，玉米粉 40，黃豆餅粉 16。

3）發(fā)酵初始培養(yǎng)基（g/L）：NaNO34，K2HPO43，MgSO41，F(xiàn)eSO4?7H20 0.01，玉米粉 40，黃豆餅粉 16。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酶活測(cè)定方法

Yoo改良法[2]：反應(yīng)體系為5mL 0.5%淀粉+0.5mL酶，在pH6.0、40℃下反應(yīng)5min后，加0.1mol/L H2SO45mL終止反應(yīng)，取0.5mL反應(yīng)液+5mL 0.4mmol/L I2-KI溶液顯色，620nm下測(cè)光密度。1個(gè)活力單位定義為5min水解1mg淀粉的酶量。

酶活的計(jì)算方法：

酶活=（對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組）/對(duì)照組×淀粉濃度×酶液稀釋倍數(shù)

1.2.2米曲霉最初發(fā)酵培養(yǎng)條件

在250mL三角瓶液體培養(yǎng)，裝液量為40mL，接種量為4mL，在235rpm、28℃的條件下培養(yǎng)72h。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

單獨(dú)選擇面粉、大米粉、糊精、淀粉、蕎麥、高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖作為碳源，替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米粉，其余培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件不變。測(cè)定酶活結(jié)果，由圖1可見(jiàn)，面粉、大米粉、淀粉、蕎麥作為碳源時(shí)，都有利于米曲霉產(chǎn)酶，而高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用較低。其中面粉對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用最大，因此選擇面粉作為最佳唯一碳源。

2.1.2不同有機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在以面粉為唯一的碳源的條件下，選擇玉米漿、蛋白胨、酵母膏、尿素、牛肉膏代替黃豆餅粉作為有機(jī)氮源，其余條件不變。測(cè)定酶活結(jié)果由圖2可看出，牛肉膏作為有機(jī)氮源有利于米曲霉產(chǎn)酶，而玉米漿、蛋白胨、酵母膏、尿素作為有機(jī)氮源時(shí)，對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用較低。從工業(yè)生產(chǎn)的角度，牛肉膏的成本太高，產(chǎn)酶促進(jìn)作用只較黃豆餅粉作為有機(jī)氮源的高一些，因此選擇黃豆餅粉作為有機(jī)氮源。

圖1 不同碳源對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶的影響

圖2 不同有機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶的影響

2.1.3不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在以面粉和黃豆餅粉的最佳濃度的條件下，選擇NaNO3、NH4NO3、KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4作為附加無(wú)機(jī)氮源。由圖3表明，NaNO3和KNO3對(duì)酶活的促進(jìn)作用較大，而NH4NO、NH4Cl、（NH4）2SO4的促進(jìn)作用較小。因此選擇NaNO3作為最佳的無(wú)機(jī)氮源。

圖3 不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶的影響

2.2 α- 淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1不同發(fā)酵初始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，得出最佳的培養(yǎng)基成分，在基礎(chǔ)上通過(guò)改變發(fā)酵液的pH值進(jìn)行發(fā)酵。測(cè)定酶活由圖4可以得到，當(dāng)pH值為7，也就是發(fā)酵液為中性的情況下，其酶活最高，而偏酸性或者偏堿性都對(duì)酶活有一定的抑制作用，隨酸度（堿度）的加強(qiáng)，抑制越明顯。因此發(fā)酵過(guò)程選擇pH值為7的條件進(jìn)行發(fā)酵。

圖4 pH對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶的影響

2.2.2不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在最佳發(fā)酵配方的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)1mL、3mL、4mL、5 mL、7mL、10mL的接種量進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比。測(cè)定酶活如圖5所示，增加接種量，對(duì)米曲霉產(chǎn)酶能力的促進(jìn)作用越大，在達(dá)到4mL接種量時(shí)，其促進(jìn)作用最大，繼續(xù)增加時(shí)，反而會(huì)使其產(chǎn)酶能力的促進(jìn)作用降低。因此選擇4mL的接種量作為最佳的接種量。

圖5 接種量對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶的影響

2.2.3不同裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

通過(guò)對(duì)25mL、35mL、40mL、45mL、55mL、70mL的裝液量進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比。測(cè)定酶活如圖6所示，裝液量的變化對(duì)于發(fā)酵的結(jié)果影響不是很大。只有在40mL和55mL裝液量情況下對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用較大一些，出于經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇40mL的裝液量作為最適裝液量。

圖6 裝液量對(duì)米曲霉產(chǎn)α-淀粉酶的影響

2.2.4 不同溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以發(fā)酵的最佳配方配制培養(yǎng)基，分別在24.5℃、28℃、30℃、33.5℃、37℃、40.5℃、44℃下進(jìn)行發(fā)酵。其結(jié)果由圖7可得，溫度升高，其產(chǎn)酶能力也隨之提高，當(dāng)?shù)竭_(dá)33.5℃時(shí)產(chǎn)酶能力最高，繼續(xù)升高溫度，產(chǎn)酶能力降低，最后當(dāng)溫度到達(dá)44℃時(shí)，產(chǎn)酶能力為0。因此米曲霉的產(chǎn)α-淀粉酶的最適溫度為33.5℃。

3 結(jié)論

通過(guò)以上優(yōu)化，發(fā)酵前后培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件比較見(jiàn)表1。

圖7 溫度對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶的影響

表1 培養(yǎng)基優(yōu)化前后α-淀粉酶產(chǎn)量對(duì)比

經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件優(yōu)化，得出最佳培養(yǎng)基配方（g/L）：面粉45，黃豆餅粉20，NaNO34，K2HPO43，MgSO41，F(xiàn)eSO4?7H20 0.01。最優(yōu)培養(yǎng)條件為：初始培養(yǎng)基pH為7，40mL的裝液量，4mL的接種量，溫度為33.5℃、轉(zhuǎn)數(shù)為235rpm。在上述發(fā)酵條件下，發(fā)酵72h后，測(cè)得最高酶活為1962.32 U/mL，而初始發(fā)酵的酶活為1365.68 U/mL，提高了45%。

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