任 勤，戴榮國，郭 軍，王瑞生，姬聰慧

（重慶市畜牧科學院蜂業(yè)研究所，重慶 榮昌 402460）

蜜蜂傳染性病害主要包括歐洲幼蟲腐臭病、美洲幼蟲腐臭病、敗血病；囊狀幼蟲病、麻痹病等；白堊病、黃曲霉病等；螺原體病以及侵襲性疾病中的蜜蜂微孢子蟲病、阿米巴病。這些疾病往往是危害養(yǎng)蜂生產(chǎn)的主要疾病。

1 主要診斷方法

1.1 培養(yǎng)鏡檢診斷方法 此方法主要用于鑒定蜜蜂細菌病、真菌病及原生動物引起的疾病，并且要求病菌在形態(tài)和染色上具有明顯的特征。在沒有細胞系可利用的情況下，培養(yǎng)是不能夠利用的。病原培養(yǎng)是診斷的基礎(chǔ)和核心，對于不同的病原要加以區(qū)分，并且有的病原在培養(yǎng)條件上有嚴格的要求（如蜜蜂幼蟲芽孢桿菌），這就給鑒定帶來了一定的難度。Alippi在1995年發(fā)明了一種半選擇培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有萘啶酸和吡哌酸，能夠在幼蟲芽孢桿菌孢子萌發(fā)之前抑制大部分芽孢桿菌的生長，為芽孢桿菌的培養(yǎng)提供了依據(jù)。Peter E.Lee和B.Furgala在1965年和1967年先后用鏡檢法對蜜蜂囊狀幼蟲病進行了檢測。有些病原體到目前為止，還沒有可行的體外培養(yǎng)方法（如蜜蜂微孢子蟲），而且體外培養(yǎng)耗時，不能夠規(guī)?；M行。

1.2 免疫學診斷方法 免疫學診斷建立在抗原與相應抗體發(fā)生可見反應這一原理的基礎(chǔ)上，有的反應不可見或難測，可以通過應用補體、溶血以及熒光素、酶和同位素標記等指示物質(zhì)，使其反應成為可見或可測的狀態(tài)。血清學方法具有嚴格的特異性和較高的敏感性，在傳染病的診斷、病原微生物的分類和鑒定以及抗原分析、免疫抗體監(jiān)測等方面，均有較廣泛的應用。其優(yōu)點不僅表現(xiàn)在可利用抗體來診斷未知的抗原或用已知的抗原來診斷未知抗體，還可以進行定量定性分析。血清學診斷方法很多，目前用于蜜蜂傳染病診斷的主要有瓊脂免疫擴散法、對流免疫電泳法、熒光抗體法（IFA）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。高純度抗體的獲得是進行血清學診斷的核心問題，目前主要是通過差速離心法獲取。

1.2.1 瓊脂免疫擴散法 免疫擴散法的原理：抗體和抗原在同一凝膠內(nèi)擴散，兩者相遇后會出現(xiàn)具有一定特征的沉淀帶，從而判斷抗體是否存在或者抗原性是否一致。Denis L.Anderson對蜂王黑變病病毒（BQCV）、慢性麻痹病毒（CBPV）、克什米爾病毒（KBV）和囊狀幼蟲病病毒（SBV）利用瓊脂免疫擴散法進行了檢測，結(jié)果證明此方法只有千分之一的敏感性，且特異性不明顯。

瓊脂本身性質(zhì)易受溫度影響，溫度過低，易凍住而變硬失效；溫度偏高，則擴散環(huán)模糊，誤差偏大。瓊脂擴散法對加血清的要求嚴格，首先是加樣器，有條件者可選用微量移液管，并且應垂直并完全加入孔中，切勿使樣品外溢，否則結(jié)果不準確；瓊脂擴散法在測量沉淀環(huán)直徑時，除用米尺外，可改用目鏡測微器，其誤差小于0.1mm，效果更好。瓊脂擴散板在溫箱內(nèi)要保持水平狀態(tài)，擴散時間不得超過48h，否則沉淀環(huán)可能呈橢圓形，不便測量；瓊脂擴散法室內(nèi)重復性不理想；瓊脂擴散法是以沉淀環(huán)直徑與抗原含量的直線關(guān)系來繪制標準曲線的，如曲線繪制不精密，誤差也會相應增大。

1.2.2 對流免疫電泳法 對流免疫電泳法的原理：抗原在堿性緩沖液中（pH 8.4以上）帶負電荷，可由負極向正極移動，而血清中抗體接近等電點，由于電滲作用，可由正極向負極滲透，兩者在短時間內(nèi)相遇后，出現(xiàn)白色沉淀線，根據(jù)沉淀線存在與否及沉淀量的多少，可以定量檢測出樣品中抗原或抗體的存在及含量。根據(jù)出現(xiàn)沉淀線和抗原稀釋倍數(shù)最高一孔的稀釋度，可以測定出被測血清的效價和應用價值。

本法由于電場的作用，限制了抗原、抗體的自由擴散，使其定向泳動，因而增加了試驗的靈敏度，并縮短反應時間。此法操作簡便，僅需30～60min，靈敏度比雙向瓊脂擴散高10～15倍，但缺點是特異性不如雙向瓊脂擴散高。

1.2.3 熒光抗體法 熒光抗體法的原理是利用異硫氰熒光素與抗體或者抗原生成復合物，以此測定抗體或者抗原的一種方法。熒光標記抗體與相應的抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡下如果有沉淀產(chǎn)生，則會在沉淀物弧中出現(xiàn)熒光。依據(jù)熒光的強度和分布，就能檢測抗原的含量和判斷抗原是否存在。

熒光抗體技術(shù)在臨床檢驗上已用于對細菌、病毒和寄生蟲的檢驗及自身免疫病的診斷等，在細菌學檢驗中主要用于菌種的鑒定。本法較其他鑒定細菌的血清學方法速度快、操作簡單、敏感性高，但在細菌實驗診斷中，一般只能作為一種補充手段使用，不能代替常規(guī)診斷。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法（簡稱ELISA）始于20世紀70年代，是一種把抗原和抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結(jié)合起來的檢測技術(shù)。其基本原理是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預先結(jié)合到某種固相載體表面，測定時將受檢樣品（含待測抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應，形成抗原或抗體復合物；反應終止時，固相載體上的酶標抗原或抗體被結(jié)合量（免疫復合物）即與標本中待檢抗體或抗原的量呈一定比例，經(jīng)洗滌去除反應液中的其他物質(zhì)，再加入酶反應底物后，底物就被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量就可確定樣品中待測物質(zhì)的含量。ELISA法比其他免疫學診斷方法的靈敏度高，特異性強。但也不可避免地存在著一些缺陷，如不能同時分析多種成分，對試劑選擇性高，對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應等。

1.3 PCR檢測診斷 PCR（聚合酶鏈式反應）技術(shù)是由美國科學家于1983年發(fā)明的一種特異基因或克隆序列的體外酶促擴增技術(shù)，隨后PCR技術(shù)迅速發(fā)展，各國研究人員也對其進行了不斷改進。目前已經(jīng)有10余種不同類型的PCR技術(shù)廣泛應用于各個領(lǐng)域。

GOVAN等將PCR技術(shù)應用在蜂球囊菌的檢測上，結(jié)果表明此技術(shù)耗時短，特異性較高。LAURO等提出利用套式PCR可直接檢測蜂蜜和蜂巢中的幼蟲芽孢桿菌孢子，且靈敏度非常高，不僅可以用于美洲幼蟲腐臭病的病情預報，還可以用于實時流行病學研究。GRABENSTE INER等對不同地區(qū)的囊狀幼蟲病毒利用逆轉(zhuǎn)錄PCR進行檢測，獲得了一致的檢測結(jié)果，此方法快速、靈敏，是檢測囊狀幼蟲病病毒的有效方法。WEBSTER等利用特異性PCR引物可以迅速檢測到蜜蜂體內(nèi)的微孢子蟲，與傳統(tǒng)的顯微鏡診斷相比,靈敏度大大提高。Elke Genersch建立了RT-PCR檢測方法，此方法在檢測蜜蜂殘翅病病毒上具有良好的呈現(xiàn)性。Elvira Grabensteiner等建立了復合TR-PCR，同時對蜂王黑變病、囊狀幼蟲病和急性蜜蜂麻痹病進行了檢測，進一步提高了檢測敏感性和特異性，并且重現(xiàn)性良好。

近年，我國利用PCR技術(shù)在蜜蜂疾病的檢測上也開始應用。周婷等利用RT-PCR對我國蜜蜂克什米爾病毒（KBV）和急性麻痹病毒（APV）進行了檢測，結(jié)果表明，到目前為止我國還沒有蜜蜂對這兩種病毒有感染。許益鵬等利用Nest-PCR對囊狀幼蟲病病毒進行了檢測，結(jié)果表明此方法可以在短時間內(nèi)檢測出病毒，可用于對囊狀幼蟲病的前期診斷。李明等報道，利用RT-PCR可以快速檢測出蜜蜂是否感染囊狀幼蟲病病毒。

PCR技術(shù)相對于其他檢測方法來說，具有快速、靈敏、耗時短的優(yōu)勢，但其本身也存在一些問題，例如由于各種污染引起的假陽性問題，尤其在病原微生物上表現(xiàn)突出；由儀器、試劑、操作等引起的假陰性問題；另外，由于蜜蜂病原樣本的采集存在一定的難度，并且病菌含量小，對檢測的靈敏度具有較高的要求。

2 結(jié)語

對蜜蜂病害的的防治目前還停留在臨床診斷階段，近幾年病害發(fā)病率有回升趨勢，而且由于臨床癥狀在初期均不典型或者呈隱性感染，容易出現(xiàn)誤診情況，而當出現(xiàn)明顯癥狀時，已經(jīng)造成經(jīng)濟損失。目前常用的培養(yǎng)鏡檢診斷由于費時費力，病原的培養(yǎng)條件苛刻，不能大規(guī)模進行，在實驗室診斷上意義不大。而免疫學反應，由于血清的獲取至少也得30d時間，故不能作出快速診斷，另一些血清學檢測方法獲得的抗原特異性差、敏感性低，容易和其他病原存在抗原性交叉，產(chǎn)生假陽性，而且不能一次確診，所以對一些潛在性或隱性傳染的疾病診斷價值不大。隨著科學技術(shù)的進步，蜜蜂疾病的實驗室診斷必然會從最初的組織形態(tài)學觀察向細胞分子診斷水平方向發(fā)展。分子技術(shù)的發(fā)展在診斷蜜蜂疾病上是一次革命，尤其是對蜜蜂病原核酸序列的破譯，將會使病原的快速檢測、診斷成為可能。

[1]王建鼎，梁 勤，蘇 榮.蜜蜂保護學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[2]吳 杰.蜜蜂病敵害防治手冊[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[3]曲 芬，成 軍.細菌性感染實驗室診斷的研究進展[J].臨床內(nèi)科雜志，2003，20（11）：564-556.

[4]金湯東，陳盛祿.我國蜜蜂疾病發(fā)生趨勢與防治技術(shù)[J].中國蜂業(yè)，2007，58（2）：23-24.

[5]Elke Genersch.Development of a rapid and sensitive RT-PCR method for the detection of deformed wing virus， a pathogen of the honeybee[J].Veterinary，2005，169：121-123.

[6]曹連飛，李亞輝.PCR技術(shù)在蜜蜂疾病診斷中的應用[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報，2006，26（6）：794-798.

[7]顏 殉，韓日疇.我國蜜蜂主要病原檢測技術(shù)[J].昆蟲知識，2008，45（3）：483-488.

[8]王 忠，叢艷峰，李玉玲.小鵝瘟血清學和分子生物學診斷方法[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009，（1）：88-89.

[9]周 婷，姚 軍.蜜蜂KBV和APV病毒RT-PCR檢測技術(shù)研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2004，35（4）：359-462.

[10]李 明，馬嗚瀟，等.遼寧地區(qū)中華蜜蜂囊狀幼蟲病的RT-PCR 檢測[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2008，（12）：25-27.

[11]許益鵬，章奕卿.蜜蜂囊狀幼蟲病毒病的Nest-PCR檢測[J].科技通報，2007，23（6）：824-827.

[12]Yanping Chen，Jay Evans， et al.Horizontal and vertical transmission of viruses in the honeybee[J].Invertebrate Pathology，2006，92：151-159.