遼寧省人民醫(yī)院(110016) 杜振廣 肖明明

中國醫(yī)科大學 94期 鄧 寧

惡性腫瘤細胞的重要生物學特性是其對周圍組織的侵襲和破壞,并在遠隔器官形成轉(zhuǎn)移灶,這是一個多環(huán)節(jié)、多步驟的復(fù)雜過程,與腫瘤細胞表面黏附分子、細胞外基質(zhì)中的蛋白水解酶類和腫瘤細胞的增殖狀態(tài)關(guān)系密切。骨肉瘤是好發(fā)于青少年的高度惡性腫瘤,其侵襲性強,較早出現(xiàn)肺等器官的轉(zhuǎn)移,且手術(shù)切除后較易復(fù)發(fā),因此對骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的相關(guān)因素進行研究具有重要的理論及臨床意義。本研究采用免疫組織化學 S-P法探討了 Bcl-2和整合素連接激酶(ILK)骨肉瘤、正常骨中表達的生物學意義,為骨肉瘤的預(yù)后判定和基因治療提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料 正常對照組 15例,骨肉瘤標本 30例。骨肉瘤取自 2002～2009年遼寧省范圍內(nèi) 4家醫(yī)院截肢、腫瘤切除或手術(shù)切取活體檢查的標本,用液氮保存。術(shù)后所有標本經(jīng) 3位病理學專家確定診斷。全部病例術(shù)前均未發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移,均未做化療,術(shù)后或確診后行相同化療方案。根據(jù)劉昌茂分級法：將其分為Ⅰ級 15例,Ⅱ級 10例,Ⅲ級 5例。隨訪結(jié)果：死亡 17例,存活 13例。分成生存組和死亡組。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆抗體 Bcl-2;鼠抗人單克隆抗體 ILK;兩者及免疫組化 S-P試劑盒均為Zymed公司產(chǎn)品。

1.3 方法 標本均經(jīng) 10%中性甲醛緩沖液固定。不含鈣固定 6～8小時,含鈣固定 24～48小時。固定后,含鈣經(jīng) 10%EDTA中性溶液脫鈣 3～5周。然后,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋,5μm連續(xù)切片。按S-P免疫組織化學染色檢測試劑盒所附操作程序進行。所有切片染色按相同條件進行染色。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 ILK染色結(jié)果判定 以胞漿呈棕黃色為陽性,至少觀察 5個具代表性的高倍視野(10×40)計數(shù)500個瘤細胞中陽性細胞數(shù),按陽性細胞所占的比例分為 5級：陰性;＜25%為Ⅰ級,25%～50%為Ⅱ級,＞50%～75%為Ⅲ級,＞75%為Ⅳ級。

1.4.2 Bcl-2染色結(jié)果判定 參照王東等的判斷標準稍加改進。陽性反應(yīng)為黃到棕黃色顆粒。定位于胞漿,亦可見于胞膜。計數(shù) 10個高倍視野(10×40),陽性細胞數(shù) ＜5%為陰性,5%～25%為 1分,＞25%～50%為 2分,＞50%～75%為 3分,75%以上為 4分。按陽性反應(yīng)強度,淡黃色計 1分,黃色計 2分,棕黃色計 3分;兩者相乘,1～4分為弱陽性(+),5～8分為中等陽性(?),9～12分為強陽性(?)。

1.5 統(tǒng)計學處理 Bcl-2陽性率的差異比較用四格表確切概率法。Bcl-2和 ILK指標染色強度比較用成組設(shè)計兩樣本比較的秩和檢驗(Wilcoxon法),Bcl-2和 ILK相關(guān)性采用 X2檢驗,取 P＜0.05作為差異有顯著性的檢驗標準。

2 結(jié) 果

2.1 Bcl-2、ILK染色 Bcl-2為細胞漿著色,呈棕黃色均勻顆粒狀。部分細胞有胞膜著色。ILK陽性細胞為細胞核呈棕黃色。

2.2 Bcl-2表達情況 骨肉瘤組與正常骨組染色陽性率和染色強度相比,差異均有顯著性(P＜0.05)。骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ級組與Ⅰ級組,死亡組與生存組染色陽性率和染色強度相比,雖有下降趨勢,但差異均無顯著性(P＞0.05),見表 1。

表1 Bcl-2表達情況

2.3 ILK表達情況 骨肉瘤組與正常骨組,骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ級組與Ⅰ級組,死亡組與生存組相比,ILK差異有顯著性(P＜0.05),見表 2。

表2 ILK表達情況(例)

2.4 Bcl-2和 ILK的相互關(guān)系 通過 2×2列聯(lián)表進行分析,發(fā)現(xiàn) Bcl-2和 ILK表達一致性占 76.7%,兩者表達具顯著相關(guān)性(P＜0.05),見表 3。

表3 Bcl-2與 ILK的關(guān)系

3 討 論

Bcl-2為拮抗細胞凋亡的基因,其產(chǎn)物并不加速細胞分裂、增殖而是促進細胞生存,作為“生存基因”保持正常或癌變細胞免受各種誘導(dǎo)劑誘發(fā)的細胞凋亡。有學者證實,Bcl-2能抑制骨肉瘤細胞系的凋亡[1-2]。本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組比正常骨組 Bcl-2蛋白染色陽性率和染色強度均增高,提示骨肉瘤發(fā)生與拮抗凋亡基因 Bcl-2表達增高有關(guān)。Bcl-2基因表達與腫瘤生物學行為的關(guān)系目前頗有爭議[3]。Bcl-2蛋白抑制細胞凋亡,理論上該基因表達越高,腫瘤惡性程度應(yīng)越高,預(yù)后應(yīng)越差。某些腫瘤如胃癌、結(jié)腸異時性腺瘤等與此相符。某些腫瘤如胰腺癌等研究結(jié)果卻與之相反。某些腫瘤如滑膜肉瘤等發(fā)現(xiàn) Bcl-2蛋白表達和預(yù)后無關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著骨肉瘤分級的增加,隨著生存時間的減少,Bcl-2蛋白染色陽性率和染色強度均有下降趨勢,但無統(tǒng)計學意義,提示 Bcl-2蛋白染色陽性率和染色強度不能作為判斷骨肉瘤分級和預(yù)后的指標。由于本研究樣本數(shù)量較小,骨肉瘤中Bcl-2蛋白表達的生物學意義尚需擴大樣本進一步研究。

ILK是新近發(fā)現(xiàn)的一個具有 3個結(jié)構(gòu)單位的Ser/Thr蛋白激酶,作為整合素和生長因子受體信號傳導(dǎo)途徑中的一個重要效應(yīng)物,ILK調(diào)節(jié)著細胞的粘著、生存、分化和凋亡[2]。其相關(guān)蛋白 PKB、GSK3等是細胞程序死亡和細胞周期循環(huán)的重要調(diào)節(jié)蛋白[4-6]。由于這些原因,使得 ILK與腫瘤的形成、浸潤轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后等密切相關(guān)。ILK在許多腫瘤中都存在過量表達,ILK的過量表達或組成性活化與腫瘤的形成和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ILK在骨肉瘤組與正常骨組,骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ級組與Ⅰ級組,死亡組與生存組相比,ILK差異有顯著性,提示 ILK在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,可通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的的合成與降解代謝而影響細胞之間,細胞與基質(zhì)之間的信息傳遞,調(diào)節(jié)細胞分化及遷移,進而可能影響腫瘤的生物學行為。

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