李華 王麗 秦星 蘇彥君 郝存勛

有研究認(rèn)為，阿片和其他成癮藥物具有共同的細(xì)胞和解剖通路，而受體后細(xì)胞、突觸和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的適應(yīng)性改變是成癮性形成的關(guān)鍵［1］。阿片類藥物與其受體結(jié)合后，通過升高細(xì)胞內(nèi)cAMP［2－4］和游離 Ca2+濃度 (intracellular free Ca2+concentra-tion，［Ca2+］i)［5，6］，分別激活 cAMP 依賴的蛋白激酶 A(cAMP-dependent protein kinase A，PKA)［2－4］及鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶(calmodulin-dependent kinase，CaMK)［7－9］，使轉(zhuǎn)錄因子 cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的Ser-133磷酸化，而持續(xù)調(diào)節(jié)其下游基因表達(dá)，參與神經(jīng)元與突觸的可塑性與適應(yīng)性［2－4，7－10］。本研究在體外觀察CRE-decoy ODN可選擇性下調(diào)慢性嗎啡誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞的CREB的DNA的結(jié)合活性、nNOS及fosB基因表達(dá)上調(diào)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在體觀察CRE-decoy ODN對(duì)嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的影響，為探尋阿片類物質(zhì)依賴的干預(yù)措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器:可調(diào)定量移液器(2～1 000 μl)購自法國Gilson公司;微量注射器購自上海醫(yī)用器材廠;S2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器購自上海強(qiáng)申生化儀器廠;江灣I-C型腦立體定位儀購自第二軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室。

1．1．2 試劑及用品:鹽酸嗎啡購自沈陽第一制藥廠;鹽酸納絡(luò)酮購自美國Sigma公司;多聚甲醛、Na2HPO4、NaH2PO4購自北京化學(xué)試劑廠;全硫代磷酸化CRE-decoy ODN(5’-TGACGTCA TGACGTCA TGACGTCA-3’)由上海Sangon公司合成。

1．1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性Wistar大鼠(清潔級(jí))40只，體重200～240 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物分組:40只Wistar大鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為5組，即0．9%氯化鈉溶液對(duì)照組，側(cè)腦室0．9%氯化鈉溶液注射對(duì)照組，嗎啡依賴組，嗎啡戒斷組，嗎啡戒斷CRE-decoy ODN治療組，每組8只。分籠飼養(yǎng)，每籠5只。實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，飼養(yǎng)溫度(24±1)℃，相對(duì)濕度50%，黑/白照明周期為12/12 h。大鼠自由飲水、進(jìn)食，保持墊料干燥。飼料中蛋白含量為20%，膽固醇含量為3．5%。

1．2．2 動(dòng)物模型制備:采用遞增劑量皮下注射建立大鼠嗎啡身體依賴模型。方案為:第1天皮下注射鹽酸嗎啡10 mg/kg，2次/d。嗎啡用量每日遞增10 mg/kg，連續(xù)5 d。第6天皮下注射嗎啡50 mg/kg，2 h后腹腔注射鹽酸納絡(luò)酮5 mg/kg進(jìn)行催癮實(shí)驗(yàn)。0．9%氯化鈉溶液對(duì)照組和側(cè)腦室0．9%氯化鈉溶液注射對(duì)照組大鼠注射等體積0．9%氯化鈉溶液。

1．2．3 大鼠側(cè)腦室微量注射:嗎啡戒斷治療組在末次注射嗎啡前30 h，對(duì)每只大鼠左側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射溶解在10 μl saline 0．9%氯化鈉溶液中的CRE-decoy ODN 20 μg。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)側(cè)腦室0．9%氯化鈉溶液注射對(duì)照組、嗎啡依賴組、嗎啡戒斷組每只大鼠則于左側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射等體積0．9%氯化鈉溶液。左側(cè)側(cè)腦室注射的具體操作過程如下:大鼠在0．4%戊巴比妥鈉(40 mg/kg，側(cè)腦室內(nèi)注射)麻醉下，根據(jù)文獻(xiàn)［11］，借助腦立體定位儀行左側(cè)側(cè)腦室注射。注藥點(diǎn):前鹵后0．8 mm，中線旁 1．8 mm，硬膜下 3．7 mm。注射體積 10 μl，20 s 完成注射后，縫合皮膚。

1．2．4 嗎啡戒斷大鼠的行為學(xué)評(píng)定

1．2．4．1 對(duì)計(jì)數(shù)和觀察癥狀評(píng)分:在納絡(luò)酮催癮之前1 h，把0．9%氯化鈉溶液對(duì)照組及行左側(cè)側(cè)腦室注射術(shù)后活動(dòng)正常的大鼠單獨(dú)放進(jìn)一個(gè)直徑30 cm、高50 cm觀測筒內(nèi)，使大鼠適應(yīng)檢測環(huán)境。腹腔注射納絡(luò)酮后，不知情的觀測者隨即觀測大鼠的戒斷行為，并進(jìn)行評(píng)分。需連續(xù)觀察1 h。①需觀測的戒斷癥狀包括兩類，即計(jì)數(shù)癥狀和觀察癥狀。計(jì)數(shù)癥狀需記錄濕狗樣抖動(dòng)、牙齒顫抖、吞咽和跳躍的發(fā)生次數(shù)，再對(duì)其進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:0=不發(fā)作，1=發(fā)作1～5次，2=發(fā)作6～10次，3=發(fā)作≥11次。每15分鐘為一時(shí)間段，連續(xù)觀測1 h內(nèi)上述行為的發(fā)生頻率，最后計(jì)算戒斷0～60 min的總評(píng)分。②需觀測6種觀察癥狀在戒斷0～60 min的出現(xiàn)程度，即上瞼下垂、流淚、流涎、豎毛、激惹(irritability)和腹瀉(diarrhea)，最后對(duì)其進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:0=未出現(xiàn)，1=輕度，2=中度，3=明顯。

1．2．4．2 體重丟失的評(píng)分:體重丟失百分率(ΔW)=納絡(luò)酮注射前與注射后1 h的體重差/納絡(luò)酮注射前體重×100%。ΔW的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:1=ΔW＜2%，5=ΔW＜4%，10=ΔW＜6%，15=ΔW＜8%，20=ΔW≥8%。

1．2．5 左側(cè)側(cè)腦室注射部位及其周圍腦組織損傷的鑒定:納絡(luò)酮注射后2 h，大鼠在0．4%戊巴比妥鈉(40mg/kg，側(cè)腦室內(nèi)注射)麻醉下，將大鼠胸腹腔切開，暴露心臟。先剪開右心耳，見血液流出后，將左心室剪開，將已注入預(yù)冷0．9%氯化鈉溶液的灌注管從左心室插入升主動(dòng)脈，快速灌注約150 ml預(yù)冷0．9%氯化鈉溶液，右心耳流出液變清亮后，灌注4%多甲醛。首先在20 min內(nèi)灌注200 ml，隨后在40 min內(nèi)灌注200 ml。取腦并將腦組織在4%多甲醛中固定2 h后，放入15%和30%梯度蔗糖溶液中直至沉底。肉眼觀察側(cè)腦室微量注射管定位。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較用S-N-K法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 側(cè)腦室微量注射管定位 觀察微量注射管定位準(zhǔn)確，對(duì)周圍腦組織損傷較小。

2．2 側(cè)腦室注射CRE-decoy ODN對(duì)大鼠戒斷癥狀的影響 大鼠的戒斷癥狀由腹腔注射鹽酸納絡(luò)酮5 mg/kg催促。在腹腔注射納絡(luò)酮前，5組大鼠均未出現(xiàn)戒斷癥狀。在嗎啡戒斷大鼠側(cè)腦室注射CRE-decoy ODN 20 μg，可明顯抑制絕大部分戒斷癥狀。0～60 min內(nèi)，CRE-decoy ODN治療組大鼠每15分鐘的行為學(xué)評(píng)分分別為(3．2 ±0．6)、(5．9 ±0．9)、(4．1 ±0．6)和(1．8±0．4)分，明顯低于戒斷組大鼠的(6．3 ±0．8)、(8．1 ±0．7)、(6．9 ±0．9)和(2．8 ±0．7)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01)。CRE-decoy ODN明顯抑制嗎啡戒斷大鼠0～60 min戒斷癥狀的總評(píng)分，使其從(24．0 ±0．7)分降至(15．0 ±0．9)分(P＜0．01)，并使反映戒斷癥狀綜合性指標(biāo)的體重丟失百分率ΔW 從(7．2 ±1．2)%降至(4．1 ±0．8)%(P ＜0．01)。

3 討論

阿片藥物成癮的主要特征為耐受、戒斷綜合征及強(qiáng)迫用藥，目前對(duì)其形成的生物學(xué)基礎(chǔ)尚未闡明［1］。研究表明，反復(fù)應(yīng)用阿片類藥物，機(jī)體啟動(dòng)適應(yīng)機(jī)制，導(dǎo)致對(duì)阿片敏感的神經(jīng)元及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能發(fā)生短期及長期改變［9］。

尋找與成癮有關(guān)的極其穩(wěn)定的分子適應(yīng)機(jī)制所遇到的困難，與學(xué)習(xí)和記憶領(lǐng)域面對(duì)的挑戰(zhàn)相同［1，10］?？赡艿臋C(jī)制之一是通過CREB介導(dǎo)很短暫的基因表達(dá)改變，而介導(dǎo)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)和突觸結(jié)構(gòu)的長期改變。例如，在海馬錐體神經(jīng)元，增加樹突突起的密度及LTP時(shí)谷氨酸能突觸的效力。另一種可能是轉(zhuǎn)錄因子CREB的短暫激活通過修飾染色質(zhì)，導(dǎo)致基因表達(dá)更持久的改變。CREB和許多其他的轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為通過促進(jìn)靶基因周圍的組蛋白發(fā)生乙?；蛉ヒ阴；せ罨蛞种瓢谢蜣D(zhuǎn)錄。盡管組蛋白乙?；蛉ヒ阴；l(fā)生非常快，但是CREB在控制組蛋白乙酰化的酶系統(tǒng)方面產(chǎn)生更持久的適應(yīng)。CREB也可能通過調(diào)節(jié)DNA或組蛋白的甲基化使基因表達(dá)發(fā)生更持久的改變［10］。

CREB主要通過cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element，CRE)介導(dǎo)cAMP和Ca2+依賴的基因表達(dá)。CRE由TGACGTCA序列組成，主要位于許多基因啟動(dòng)子內(nèi)TATA盒上游100個(gè)核苷酸處［7，11］。酶復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控CREB的活性。細(xì)胞外刺激通過升高細(xì)胞內(nèi)cAMP或游離Ca2+，在數(shù)分或數(shù)秒鐘后，CREB便被激活。隨著胞外刺激引起胞漿內(nèi)cAMP水平升高，PKA的催化和調(diào)節(jié)亞單位迅速分離，催化亞單位被動(dòng)移位至細(xì)胞核，并在細(xì)胞受到刺激后15～20 min達(dá)到高峰。PKA導(dǎo)致CREB內(nèi)的PKA磷酸化位點(diǎn)(RRPSY)中Ser-133磷酸化。Ser-133磷酸化被認(rèn)為是介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵事件，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高通過Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶Ⅳ(calmodulin-dependent kinaseⅣ，CaMKⅣ)使 Ser-133磷酸化。Ca2+激活CREB可通過鈣調(diào)蛋白從胞漿移位到胞核。當(dāng)CREB經(jīng)磷酸化激活形成pCREB時(shí)，pCREB便于特定的DNA序列CRE結(jié)合，從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄［7］。CREB與CRE結(jié)合形成的復(fù)合物是多效性激活劑，參與多種細(xì)胞及病毒基因轉(zhuǎn)錄。目前已知引起神經(jīng)元可塑性和適應(yīng)性改變，參與藥物依賴和耐受的mPer1［11，12］、nNOS［13］、CCK［14］和 fosB［15］基因等也受 CREB 調(diào)控。有研究認(rèn)識(shí)到晝夜節(jié)律基因mPer1表達(dá)上調(diào)與藥物依賴密切相關(guān)，應(yīng)用核酶切割mPer1基因有效減輕嗎啡戒斷小鼠的戒斷癥狀［12］。在體內(nèi)應(yīng)用NOS拮抗劑或反義寡核苷酸，阻斷NO的產(chǎn)生，可有效減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的嗎啡依賴及耐受，故NO被認(rèn)為參與了嗎啡依賴和耐受［13］。CCK具有拮抗內(nèi)源性阿片肽的作用，CCK-8是抗內(nèi)源性阿片肽作用最強(qiáng)的神經(jīng)肽，應(yīng)用CCK-BR拮抗劑緩解大鼠嗎啡戒斷癥狀［14］?！鱂osB被認(rèn)為是一種持續(xù)表達(dá)的分子開關(guān)，使急性藥物反應(yīng)逐步轉(zhuǎn)化成相對(duì)穩(wěn)定的適應(yīng)狀態(tài)，造成藥物成癮時(shí)長期的神經(jīng)元和行為可塑性改變［10］。

本研究以CREB為靶點(diǎn)，體外合成CRE-decoy ODN，在證明了CRE-decoy ODN能選擇性抑制慢性嗎啡誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞CREB的DNA結(jié)合活性升高、nNOS和fosB基因表達(dá)上調(diào)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證實(shí)側(cè)腦室單次注射20 μg CRE-decoy ODN可明顯抑制嗎啡戒斷大鼠的戒斷癥狀。由于已證明在培養(yǎng)的SKN-SH細(xì)胞內(nèi)，CRE-decoy ODN與細(xì)胞作用48 h仍能以非整合形式在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，故我們選擇在納絡(luò)酮注射前30 h行側(cè)腦室注射CRE-decoy ODN，基于兩方面的考慮:(1)使側(cè)腦室注射損傷有一定的愈合時(shí)間，盡可能減低對(duì)行為學(xué)觀察結(jié)果造成的影響;(2)保證有足夠的CRE-decoy ODN能發(fā)揮作用。

在實(shí)驗(yàn)分組時(shí)中，設(shè)立側(cè)腦室注射對(duì)照組，通過比較側(cè)腦室注射對(duì)照組與0．9%氯化鈉溶液對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者無差異。另外，通過腦組織灌注固定，肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射未對(duì)周圍腦組織造成明顯破壞。故可基本排除側(cè)腦室注射造成的損傷對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能產(chǎn)生的影響。

本研究證實(shí)，CRE-decoy ODN可降低嗎啡戒斷大鼠每15分鐘內(nèi)戒斷癥狀的評(píng)分(1 h內(nèi))、1 h內(nèi)戒斷癥狀的總評(píng)分及體重丟失的戒斷評(píng)分，為探尋阿片類物質(zhì)依賴的干預(yù)措施提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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