苗曉杰，蔣恩臣，王 佳，杜衍紅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，廣州 510640）

目前，國(guó)內(nèi)外測(cè)定尿素含量的方法主要有尿素酶法[1]、硫酸消煮甲醛法和二乙酰單肟比色法[2]。尿素酶法是在一定酸度的溶液中用尿素酶將尿素態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨，再用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。此方法用于檢測(cè)含有尿素酶活性抑制劑的緩釋尿素時(shí)存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化不完全等問(wèn)題，使得測(cè)試值和真實(shí)值之間有很大差異[3]。硫酸消煮甲醛法則操作繁瑣，滴定終點(diǎn)不易判斷，其中使用的化學(xué)試劑甲醛對(duì)人體腎臟、眼膜等器官都有損害[4]。二乙酰單肟比色法檢測(cè)限低，可以測(cè)定微量尿素，但是其操作步驟繁瑣，熱穩(wěn)定性差，精密度和準(zhǔn)確度都不夠理想。

對(duì)二甲氨基苯甲醛能夠在酸性條件下和尿素反應(yīng)生成檸檬黃色物質(zhì)，可依此用比色法測(cè)定尿素含量[5－6]。雖然有些研究者據(jù)此提出一些具體檢測(cè)方法[3－4,7－8]，但大多存在所用試劑定量不夠精確，操作步驟不夠清晰等問(wèn)題，本文在參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)資料的基礎(chǔ)上，多次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和探索論證，提出了以對(duì)二甲氨基苯甲醛為顯色劑，利用分光光度法檢測(cè)水中常量尿素的具體可行方法。

1 實(shí)驗(yàn)原理

根據(jù)Ehrlich反應(yīng)原理，對(duì)二甲氨基苯甲醛[（CH3）2NC6H4CHO]可以和各種含氮有機(jī)化合物發(fā)生顯色反應(yīng)。對(duì)二甲氨基苯甲醛與尿素 [(NH2)2CO]反應(yīng)可生成檸檬黃色物質(zhì)。其反應(yīng)方程式為：

2 試驗(yàn)材料與儀器

可見(jiàn)分光光度計(jì)（V－1100，上海美譜達(dá)儀器有限公司）；

25 mL比色管，1 cm玻璃比色皿；

無(wú)水乙醇（分析純），對(duì)二甲氨基苯甲醛（分析純），硫酸（分析純），尿素（分析純）；

對(duì)二甲氨基苯甲醛（PDAB）顯色劑：稱(chēng)取20.00 g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于1 000 mL無(wú)水乙醇中；

2 mol·L－1硫酸溶液：按 V（濃硫酸）∶V（水）=1∶8配制；

1 000 μg·mL－1尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取 1.000 g（稱(chēng)準(zhǔn)至0.0001 g）尿素溶解于1 000 mL去離子水中。

3 試驗(yàn)方法與結(jié)果分析

3.1 條件試驗(yàn)

3.1.1 波長(zhǎng)的選擇

取 10 mL 1 000 μg·mL－1的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液3 mL，再加入2 mL去離子水，混合搖勻，靜置10 min。然后以空白試劑為參比，在不同波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度?？瞻自噭┑呐渲品椒椋喝?0 mL去離子水加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液3 mL，再加入2 mL去離子水，混合搖勻，靜置10 min。所得試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 尿素與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光度Fig.1 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea under different wavelength

從圖中的函數(shù)圖像以及對(duì)應(yīng)的點(diǎn)的坐標(biāo)數(shù)據(jù)可以看出，尿素樣品反應(yīng)溶液在400～460 nm范圍內(nèi)有一個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰，在422 nm處有最大吸收值1.545。故選用422 nm作為試驗(yàn)所用波長(zhǎng)。

3.1.2 PDAB顯色劑用量的選擇

固定 1 000 μg·mL－1尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量 10 mL，2.0 mL·L－1硫酸溶液加入量3 mL，改變PDAB顯色劑的用量，用去離子水定容至25 mL，在比色管中混合均勻靜置10 min后，在422 nm下測(cè)定反應(yīng)溶液的吸光度以及對(duì)應(yīng)空白試劑的吸光度，此處對(duì)應(yīng)空白試劑是指以等量去離子水代替尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余配比跟對(duì)應(yīng)樣品溶液相同。所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 PDAB顯色劑用量對(duì)尿素與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)溶液吸光度的影響Table 1 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by dosage of PDAB

在給定條件下，隨著PDAB顯色劑加入量的增大，反應(yīng)溶液的吸光度不斷增大，在PDAB顯色劑為10 mL時(shí)達(dá)到最大值，而后開(kāi)始減小?？瞻自噭┑奈舛葎t隨PDAB顯色劑加入量的增大而不斷增大。根據(jù)樣品反應(yīng)溶液的吸收盡量大，空白試劑的吸收盡量小的原則，選定10 mL作為PDAB顯色劑的用量。

3.1.3 硫酸溶液用量的選擇

固定 1 000 μg·mL－1尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量 10 mL，PDAB 顯色劑的用量 10 mL，改變 2.0 mol·L－1硫酸溶液加入量，用去離子水定容至25 mL，在比色管中混合均勻靜置10 min后，在422 nm下測(cè)定反應(yīng)溶液的吸光度以及對(duì)應(yīng)空白試劑的吸光度，此處對(duì)應(yīng)空白試劑是指以等量去離子水代替尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余配比跟對(duì)應(yīng)樣品溶液相同。所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 硫酸溶液用量對(duì)尿素與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)溶液吸光度的影響Table 2 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by dosage of sulfuric acid

在給定條件下，隨著硫酸溶液加入量的增大，反應(yīng)溶液的吸光度不斷增大，在硫酸溶液從4 mL變化到5 mL時(shí)增幅急劇減小?？瞻自噭┑奈舛入S硫酸溶液加入量的增大而增大，在硫酸溶液從4 mL變化到5 mL時(shí)增幅也急劇減小。在硫酸溶液為4 mL時(shí)，反應(yīng)溶液和空白試劑的吸光度之差為1.561，硫酸溶液為5 mL時(shí)，反應(yīng)溶液和空白試劑的吸光度之差為1.560。測(cè)定尿素含量時(shí)若以空白試劑做參比，過(guò)強(qiáng)的背景吸收必然增大樣品吸光度的離差，直接影響方法的精度和檢出能力。根據(jù)樣品反應(yīng)溶液的吸收盡量大，空白試劑的吸收盡量小的原則，選定4 mL作為硫酸溶液加入量。

3.1.4 顯色反應(yīng)時(shí)間的選擇

取 10 mL 1 000 μg·mL－1的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液4 mL，再加入1 mL去離子水，混合搖勻。然后在440 nm下，以去離子水為參比，測(cè)定其不同時(shí)間吸光度，同時(shí)測(cè)定空白試劑的吸光度?？瞻自噭┑呐渲品椒椋喝?0 mL去離子水加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液 4 mL，再加入 1 mL去離子水，混合搖勻。所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示。

尿素與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，溶液顯色反應(yīng)在5 min內(nèi)即可基本完成，在反應(yīng)時(shí)間為10～600 min內(nèi)，顯色溶液的吸光度非常穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間放置后所測(cè)結(jié)果會(huì)稍微有所增大。綜合以上分析，確定顯色反應(yīng)時(shí)間為10 min。

表3 尿素與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)溶液在不同顯色時(shí)間下的吸光度Table 3 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by reaction time

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)試方法的建立

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取 8 支 25 mL 比色管，分別加入 1 000 μg·mL－1的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.5、1、2、4、5、8、10 mL，然后分別補(bǔ)充去離子水10、9.5、9、8、6、5、2、0 mL定容到10 mL刻度處，由此可以得到各為10 mL的尿素含量分別為0、50、100、200、400、500、800、1 000 μg·mL－1的系列溶液。然后在每支比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L－1的硫酸溶液4 mL，然后加入去離子水定容至25 mL刻度處，混合搖勻，靜置10 min。然后以第一支比色管的反應(yīng)溶液（即空白試劑）做參比溶液，在422 nm下分別測(cè)定8支比色管反應(yīng)溶液的吸光度。所得結(jié)果如表4所示。

通過(guò)數(shù)據(jù)分析軟件SPSS（13.0版本）進(jìn)行線性回歸分析，得到顯色溶液吸光度Y與尿素含量X（μg·mL-1）的關(guān)系式：X（尿素濃度，μg·mL-1）=628.871*Y（吸光度）-5.742（R=1.000，R2=1.000），兩者呈現(xiàn)出極顯著的線性關(guān)系?；貧w直線如圖2所示。

表4 不同濃度尿素與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)溶液的吸光度Table 4 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by dosage of sulfuric acid

圖2 對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測(cè)定尿素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of spectrophotometry with PDAB as chromogenic agent to determine urea concentration

3.2.2 測(cè)試方法

取待測(cè)樣品溶液10 mL加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L-1的硫酸溶液4 mL，然后加入去離子水定容至25 mL刻度處，混合搖勻，靜置10 min后，在422 nm下，以空白試劑為參比，測(cè)定其吸光度。然后把吸光度帶入到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式中，通過(guò)換算就可求出待測(cè)樣品所含尿素濃度?？瞻自噭┑呐渲品椒椋喝?0 mL去離子水加入25 mL比色管中，加入PDAB顯色劑10 mL，2 mol·L-1硫酸溶液4 mL，再加入1 mL去離子水，混合搖勻，靜置10 min。若待測(cè)樣品尿素含量濃度過(guò)高，則可以適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行顯色測(cè)定。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別配制低中高6種濃度的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白試劑做參比溶液，在前文所選定的試驗(yàn)條件下分別測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品溶液重復(fù)測(cè)定8次，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測(cè)定尿素含量精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)Table 5 Precision and accuracy experiment of spectrophotometry with PDAB as chromogenic agent to determine urea concentration

然后把測(cè)得的吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得尿素濃度，利用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS（13.0版本）計(jì)算平均值并進(jìn)行誤差和偏差分析，同時(shí)與利用二乙酰單肟比色法方法測(cè)得的數(shù)值進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測(cè)定尿素含量精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)Table 6 Precision and accuracy experiment of spectrophotometry with PDAB as chromogenic agent to determine urea concentration

從數(shù)據(jù)軟件分析結(jié)果可以看出，利用對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測(cè)定尿素含量，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的尿素濃度平均值與標(biāo)準(zhǔn)樣品的尿素濃度的絕對(duì)誤差較小，相對(duì)誤差低于0.51%，中高濃度相對(duì)誤差不超過(guò)0.30%。標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）不超過(guò)10‰，表明方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。階梯加標(biāo)回收率在99.08%～100.74%之間，表明可以采用線性校準(zhǔn)方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的穩(wěn)定性和可靠性[9]。與二乙酰單肟比色法方法測(cè)得的值比較可以看出，對(duì)同一濃度樣品，兩種方法測(cè)定的結(jié)果差別不大，這從另一方面驗(yàn)證了對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測(cè)定尿素含量的準(zhǔn)確性和可靠性。

3.4 檢出限和干擾分析

利用對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測(cè)定尿素含量，顯色溶液吸光度與尿素含量?jī)烧叱尸F(xiàn)出極顯著的線性關(guān)系。根據(jù)分光光度法檢出限的確定原則[10]，一般以能給出吸光度為0.010的溶液濃度為檢出限。把這一數(shù)值帶入所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可以求得本方法的檢出限為0.5 μg·mL－1，若檢測(cè)高濃度尿素溶液，可以先進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)粰z測(cè)超低濃度的尿素溶液，可以配制更低濃度的標(biāo)準(zhǔn)尿素溶液，建立新的標(biāo)準(zhǔn)曲線或者選擇其他方法。

關(guān)于測(cè)試樣品中干擾的問(wèn)題通常有以下情況：①氨的干擾。氨的干擾在于消耗酸，通過(guò)酸度改變使樣品和試劑的色度發(fā)生變化。酸度降低時(shí)，溶液吸光度會(huì)下降，但氨溶于水后生成的銨離子對(duì)色度具有微弱的增強(qiáng)作用，可以部分補(bǔ)償溶液色度的降低。此外可以采用加大酸用量的方法消除氨的影響。②聯(lián)氨的干擾。低濃度的聯(lián)氨不會(huì)產(chǎn)生干擾，因?yàn)閷?duì)二甲氨基苯甲醛對(duì)尿素的敏感度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于聯(lián)氨，若樣品中有較高濃度聯(lián)氨存在時(shí)，可以采用加碘氧化法除去。③Fe3+的干擾。Fe3+在水溶液中顯黃色，其色度會(huì)對(duì)測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生影響，可以借助還原劑（抗壞血酸、鹽酸羥胺等）將Fe3+還原為Fe2+消除其影響。對(duì)于普通水溶液中常見(jiàn)的其他物質(zhì)，尚未發(fā)現(xiàn)干擾。

4 結(jié)論

本文通過(guò)條件試驗(yàn)，精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)，建立了對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測(cè)定尿素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線和操作步驟。利用對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法測(cè)定尿素含量具有精密度高、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、操作性強(qiáng)、步驟簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于水溶液中常微量尿素含量的測(cè)定。

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