韓建春，李名遠，李 杰

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

抗高血壓肽（Antihypertensive peptide，AHP）是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制劑，可通過抑制人體血管緊張素Ⅱ的生成達到降低血壓的目的[1]。它源于食品，能夠降低人體血壓，且毒副作用小[2－4]。近年來很多研究采用酶解法已從牛奶、乳酪、大豆等不同的天然蛋白質(zhì)中獲取得到了具有較好ACE抑制活性的酶解抗高血壓肽，但其提取步驟繁瑣、產(chǎn)率低，限制了抗高血壓肽的研究和開發(fā)[5－6]?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展為降血壓肽的開發(fā)利用帶來了契機。利用基因工程技術(shù)來生產(chǎn)食品原料、藥物已越來越多，為利用基因工程技術(shù)制備抗高血壓肽提供了很好的借鑒[7－9]。目前，國內(nèi)這方面的研究還正處于起步階段，研究報道不多?；蚬こ讨苽淇垢哐獕弘目朔酥苯訌膭印⒅参?、微生物原料中分離提取抗高血壓肽篩選水解酶類的盲目性（特異性蛋白水解酶事先選定），以及純化工藝的復(fù)雜繁瑣性，而且不受原料來源的限制，生產(chǎn)周期短，下游分離純化工藝簡單，便于進行大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢，因此，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究根據(jù)Maruyama等[10]于1982年報道，在牛乳酪蛋白的胰蛋白水解物中分離到了一種在體外具有ACE抑制活性的抗高血壓生物活性七肽，經(jīng)動物體內(nèi)實驗已經(jīng)證明具有降低血壓作用[11－12]。利用基因工程技術(shù)，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性，人工合成了具有較高活性的抗高血壓七肽串聯(lián)基因序列，并構(gòu)建酵母表達載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。進一步對表達的蛋白進行分析，為抗高血壓七肽的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種及載體

大腸桿菌DH5α、畢赤酵母GS115由本實驗室保存；pPIC9載體由本實驗室保存。

1.1.2 試劑及酶類

DNA片段回收試劑盒（鼎國生物工程公司）；ACE和底物馬尿酸酰組氨酸酰亮氨酸（Sigma公司）；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、rTaq酶、dNTPs（大連寶生物工程公司TaKaRa）；T載體（Promega公司）；其他化學(xué)試劑皆為分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

BIO－RAD Mini－PROTEIN3 蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)；Amersham Biosciences Ultrospec 1100pro紫外分光光度計；BIO－RAD PTC－200 PCR儀；OMEGA 10TM凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗高血壓七肽串聯(lián)基因的合成

合成抗高血壓七肽串聯(lián)基因的引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成：

AHSP－1：5′CTCGAGAAAAGAGAGGCTG3′XhoⅠAHSP－2：5′CTGGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT GCTGTTCCATACCCACAAAG 3′

AHSP－3：5′TTTGTGGGTATGGAACAGCTCTTT GTGGGTATGGGACAGCTCTTTGTGGGTATGGAAC3′

AHSP－4：5′GCGGCCGCTTATCTTTGTGGGTATG GAACAG3′NotⅠ

合成分兩輪PCR進行，第一輪是引物AHSP－1、AHSP－2進行PCR反應(yīng)，第二輪是以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，引物AHSP－1、AHSP－3進行PCR反應(yīng)?；厥?50～500 bp的PCR產(chǎn)物加A后連接T載體，轉(zhuǎn)化DH5α中。挑取單菌落，在Amp+的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取過夜培養(yǎng)物，提取質(zhì)粒，并酶切電泳初步鑒定，選出陽性菌株，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。目的基因片段的回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化均按基因工程常規(guī)方法操作。

1.2.2 畢赤酵母重組質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建

利用XhoⅠ和NotⅠ酶切陽性克隆得到的串聯(lián)基因片段，經(jīng)0.8%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳后回收。將其與同樣經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ酶切的表達載體pPIC9按照一定比例混合，加入T4DNA連接酶，16℃連接過夜。然后轉(zhuǎn)化DH5α，挑取轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基37℃，200 r·min－1振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切鑒定。

1.2.3 目的蛋白的表達

①挑選鑒定正確的單菌落，置于裝有25 mL BMG培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于28～30℃，250～300 r·min－1培養(yǎng)至 OD600=2.000～6.000（約 16～18 h）。

② 室溫下 1 500～3 000 r·min－1離心 5 min，收集菌體，用BMM重懸菌體，使OD600=1.000左右（約 100～200 mL）；

③將步驟2所得的菌液置于1 L的搖瓶中，用雙層紗布封口，30 ℃、250～300 r·min－1繼續(xù)生長；

④每24 h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5%～1.0%；

⑤按時間點分別取菌液樣品，取樣量為1 mL，置于1.5 mL離心管中，最大轉(zhuǎn)速離心2～3 min，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達量和菌液最佳收獲時間[13]。

1.2.4 表達產(chǎn)物濃縮

用TCA沉淀法濃縮畢赤酵母表達上清中的蛋白：

① 取誘導(dǎo)表達的菌液 1.5 mL，13 000 r·min－1，離心2 min，收集上清；

②取l mL上清置于1.5 mL離心管中，加入100 μL 100%TCA（預(yù)先放于4℃），顛倒混勻數(shù)次；

③樣品置于冰浴中大約30 min（或在冰箱內(nèi)放置 15 min）；

④ 13 000 r·min－1，離心 10 min，可見有棕褐色沉淀，倒掉上清;

⑤將離心管倒扣在吸水紙上，于37℃烘箱烘干10～20 min，待管底無明顯液體殘留時，加入200 μL冰冷的丙酮（預(yù)先放于－20℃），輕彈離心管的管壁，洗去管底和管壁殘留的TCA；

⑥ 13 000 r·min－1，離心 10 min，用 20 μL 槍頭吸凈管底殘留的液體（操作盡量要快，不然沉淀容易散開，影響蛋白回收率），將離心管倒置于吸水紙上，37℃烘箱烘干5 min，確認管壁和管底沒有液體殘留；

⑦加入20～50 μL凝膠加樣緩沖液，95℃加熱10min使沉淀溶解，也可用手指輕彈管壁或用20μL槍頭吹打，以促進蛋白溶解。

1.2.5 半抑制濃度的測定

將表達蛋白水解物冷凍干燥，用BBS溶液將其溶解配成試驗需要濃度的溶液，按照水解物ACE抑制率的檢測方法測定其抑制活性，以濃度為橫坐標，ACE抑制率為縱坐標繪制曲線，使用Origin 7.5軟件中的多項式擬合程序?qū)η€進行擬合，從得到的擬合方程中計算出當(dāng)ACE抑制率為50%時，水解物的濃度即為半抑制濃度值（IC50）。

1.2.6 表達產(chǎn)物ACE抑制活性的檢測

在Nakamura等方法上進行改進[14－15]。具體見表1。

表1 表達產(chǎn)物ACE抑制活性的檢測Table 1 Assay of ACE inhibitory activities （μL）

將 ACE 酶底物 Hip－His－Leu（HHL）溶于 0.1 mol·L－1的含 0.3 mol·L－1NaCl的硼酸緩沖液中（pH 8.3），配制成5mmol·L－1的濃度。取100μL5mmol·L－1Hip－His－Leu 溶液，與 40 μL ACE 抑制肽（胰蛋白酶水解產(chǎn)物）混合（預(yù)先將水解產(chǎn)物pH調(diào)至8.3），在37℃條件下溫育3 min。加入10 μL的0.1 U·mL－1的ACE酶（用去離子水配制），37℃條件下反應(yīng)30 min，加 250 μL，1 mol·L－1的 HCl終止反應(yīng)。然后在反應(yīng)體系中加入1.0 mL乙酸乙酯萃取馬尿酸，旋渦混合 15 s，在 10 000 r·min－1下離心 10 min，將上層的乙酸乙酯0.7 mL轉(zhuǎn)移到一個干凈的5 mL青霉素小瓶中，于120℃的干燥箱中干燥15 min，加熱除去乙酸乙酯。然后再用5 mL的去離子水溶解馬尿酸，在228 nm處測量其OD值。ACE酶的抑制程度用百分比來表示，計算方法為：

式中，A表示ACE及ACE抑制物都存在的條件下的OD值（實測值）；B表示ACE抑制物不參與反應(yīng)的條件下測得的OD值（對照值）；C表示ACE不參與反應(yīng)的條件下的OD值（空白值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗高血壓七肽串聯(lián)基因的合成

抗高血壓七肽串聯(lián)基因AHP7P的合成如圖1和 2所示。圖1是引物 AHSP－2、AHSP－3進行PCR結(jié)果，圖2是利用引物AHSP－1與AHSP－4及前步PCR產(chǎn)物的連續(xù)重疊延伸獲得不同長度的含抗高血壓七肽串聯(lián)序列。從圖1可以看出，第一輪PCR獲得100～1 000 bp的彌散擴增片段，符合預(yù)期結(jié)果。圖2是以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，引物AHSP－1、AHSP－4進行PCR擴增的結(jié)果，獲得了100～1 000 bp的彌散擴增產(chǎn)物?；厥?50～500 bp的片段進行加A反應(yīng)，產(chǎn)物回收后連接pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中。提取質(zhì)粒進行Eco RⅠ和HindⅢ雙酶切初步鑒定（見圖3）。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析出現(xiàn)約2 700、250 bp的2條譜帶，表明目的片段成功與T載體連接。將重組質(zhì)粒命名為pMD－AHP7P，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

重組質(zhì)粒測序結(jié)果為:CTCGAGAAAAGAGAG GCTGAAGCTGCTGTTCCATACCCACAAAGGCTGTT CCATACCCACAAAGAGCTTTCCATACCCACAAAGA GCTGTTCCATACCCACAAAGAGCTGTCCCATACCC ACAAAGAGCTGTTCCATACCCACAAAGAGCTGTTC CATACCCACAAAGAGCTGTTCCATACCCACAAAG AGCTGTTCCATACCCACAAAGAGCTGTTCCATACC CACAAAGAGCTGTTCCATACCCACAAAGAGCTGTC CCATACCCACAAAGAGCTGTTCCATACCCACAAAG ATAAGCGGCCGC

圖1 第一輪PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of the first cycle

圖2 第二輪PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR product of the secend cycle

預(yù)測由該基因編碼的多肽鏈氨基酸序列為：Leu－Glu－Lys－Arg－Glu－Ala－Glu－Ala－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg－***－Ala－Ala，即 Leu－Glu－Lys－Arg－Glu－Ala－Glu－Ala－（Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg）13。其中 Leu－Glu－Lys－Arg－Glu－Ala－Glu－Ala 為信號肽切割位點，經(jīng)畢赤酵母自身信號肽酶切割后分泌蛋白序列為（Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg）13。該序列經(jīng)胰蛋白酶酶解將獲得抗高血壓七肽 Ala－Val－Pro－Tyr－Pro－Gln－Arg。表明已成功獲得抗高血壓七肽串聯(lián)基因序列。

圖3 pMD-AHP7P載體Eco RⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of vector pMD-AHP7P by Eco RⅠand HindⅢ

2.2 抗高血壓七肽串聯(lián)基因畢赤酵母表達載體的構(gòu)建

用 XhoⅠ和 NotⅠ雙酶切質(zhì)粒 pMD－AHP7P，回收300 bp的目的片段。將pPIC9載體同樣用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，回收載體大片段。將兩個回收的片段連接構(gòu)建表達載體pPIC9－AHP7P，載體構(gòu)建過程見圖4。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到的轉(zhuǎn)化子用Bam HⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，切出約560 bp條帶，說明載體構(gòu)建正確。鑒定正確的轉(zhuǎn)化子用于下一步試驗，酶切鑒定結(jié)果見圖5。

圖4 pPIC9-AHP7P載體的構(gòu)建Fig.4 Construction of vector pPIC9-AHP7P

2.3 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的表達載體pPIC9－AHP7P用BglⅡ酶線性化，酶切結(jié)果見圖6，回收約7.0 kb的片段。制備畢赤酵母GS115菌株的感受態(tài)，通過電擊將回收的線性化片段轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，在MD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果見圖7。

采用反復(fù)凍融法裂解酵母，取裂解產(chǎn)物直接進行PCR，并以pPIC9－AHP7P載體質(zhì)粒為陽性對照，空載體為陰性對照。結(jié)果得到的2個酵母轉(zhuǎn)化子均為陽性。PCR結(jié)果見圖8。

2.4 畢赤酵母誘導(dǎo)表達蛋白的SDS-PAGE檢測

將表達載體pPIC9－AHP7P轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株，然后接于BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=2.000～6.000（約16～18 h），收集菌體，用BMM培養(yǎng)基重懸菌體，使OD600=1.000左右（約100～200 mL）。每24 h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5%～1.0%，誘導(dǎo)菌株經(jīng)超聲波破碎處理，進行SDS－PAGE分析。SDS－PAGE分析表明（見圖9），與未經(jīng)誘導(dǎo)的對照以及誘導(dǎo)的pPIC9空載體對照相比，經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌有明顯的重組蛋白表達帶。經(jīng)計算目的蛋白分子質(zhì)量約為12 ku。電泳結(jié)果與預(yù)計相符。

圖5 pPIC9-AHP7P載體Bam H I和NotⅠ雙酶切鑒定結(jié)果Fig.5 Identification of vector pPIC9-AHP7P by Bam H I and NotⅠ

圖6 pPIC9-AHP7P載體BglⅡ酶切線性化結(jié)果Fig.6 Digestion of vector pPIC9-AHP7P by BglⅡ

2.5 半抑制濃度的測定

在評價食源性ACE抑制肽活性強弱時，IC50值是不依附與樣品濃度，最直觀的評價指標，為了更加準確地評價表達蛋白水解物對ACE抑制活性的大小，進行了不同純化階段的表達蛋白水解物ACE抑制肽的IC50值測定。以樣品濃度為橫坐標，該濃度下樣品ACE抑制率為縱坐標繪制曲線，如圖10所示。從圖10中可以看出，隨著樣品濃度的增加，ACE抑制活性逐漸增大，說明樣品濃度與其ACE抑制活性有一定的效應(yīng)關(guān)系，但當(dāng)濃度增加到一定時，ACE抑制活性趨于穩(wěn)定。通過Origin 7.5軟件進行回歸分析得到擬合出的方程，通過方程計算出當(dāng)ACE抑制率為50%時樣品的濃度，即為樣品的IC50值，由方程可以算出樣品的IC50值為0.0203 mg·mL－1。

圖7 pPIC9-AHP7P載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母結(jié)果Fig.7 Result of vector pPIC9-AHP7P transformation into Pichia pastoris by electroporation

圖8 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果Fig.8 Identification of transformants by PCR

2.6 表達產(chǎn)物的ACE抑制活性

表達產(chǎn)物經(jīng)胰蛋白酶水解后，體外ACE酶抑制活性研究表明，水解產(chǎn)物的ACE酶活性的抑制率達65.12%，具有抗高血壓肽活性。

圖9 重組表達抗高血壓肽的SDS-PAGE分析Fig.9 Analysis of recombinant expressed antihypertensive peptide by SDS-PAG

M-低分子質(zhì)量蛋白Marker；1-甲醇誘導(dǎo)的pPIC9-AHP7P菌株上清；2-甲醇誘導(dǎo)pPIC9-AHP7P菌株沉淀；3-沒有誘導(dǎo)的pPIC9-AHP7P菌株上清；4-誘導(dǎo)的pPIC9菌株上清

M-Standard protein molecular weight；1-Recombinant supernate strain pPIC9AHP7P induced by Methanol；2-Recombinant precipitation strain pPIC9-AHP7P induced by methanol；3-Uninduced recombinant supernate strain pPIC9-AHP7P；4-Supernate strain pPIC9 induced by methanol

圖10 表達蛋白水解物濃度與ACE抑制活性關(guān)系曲線Fig.10 Active relations curve of expresses protein hydrolysate density and ACE suppresses

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高，現(xiàn)代富貴病發(fā)病率逐年上升，高血壓已成為危及人們身體健康的主要的疾病。利用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑類藥物抑制ACE的活性是臨床治療高血壓的重要途徑[15]。目前已有十幾種化學(xué)合成藥物作為降血壓藥物用于臨床治療，長期服用有一定的副作用[16]。而源于天然食物原料的抗高血壓肽，也是一種有效的ACE抑制劑。通過酶解方法分離制備多種抗高血壓肽國內(nèi)外已有很多報道[17-19]。但是該方法分離純化過程環(huán)節(jié)多、產(chǎn)量低，限制了抗高血壓藥品及保健品的產(chǎn)業(yè)化[20-21]。當(dāng)前利用微生物基因工程技術(shù)高效表達外源蛋白質(zhì)及多肽已成為解決從天然原料分離純化蛋白質(zhì)多肽低效率、低產(chǎn)率的重要技術(shù)，因此本研究采用基因工程技構(gòu)建高表達抗高血壓七肽的基因工程菌。

4 結(jié)論

抗高血壓肽屬小分子功能肽，這類多肽由于比較短?。ㄒ话阒挥袔讉€至十幾個氨基酸），利用基因工程菌表達時存在表達產(chǎn)物易被降解、表達量低等難題[22-25]。本研究通過特定的反常規(guī)PCR將引物重疊延伸合成出一條編碼重復(fù)七肽序列的串聯(lián)基因，將畢赤酵母表達載體pPIC9與PCR合成的目的基因連接，構(gòu)建了目的基因的酵母表達載體pPIC9-AHP7P。將表達載體pPIC9-AHP7P通過電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母，使其在畢赤酵母中表達，通過甲醇誘導(dǎo)，表達產(chǎn)物經(jīng)胰蛋白酶水解后，體外ACE酶抑制活性研究表明，水解產(chǎn)物的ACE酶活性的抑制率達65.12%。通過試驗確定了畢赤酵母表達蛋白酶切產(chǎn)物IC50值為0.0203 mg·mL-1?；谝陨涎芯恐亟M抗高血壓肽可以進一步研制成為功能性食品乃至降血壓藥物，對提高國民健康水平有極重要的現(xiàn)實意義和廣泛的應(yīng)用前景。

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