張洪微,楊銘鐸,吳瑩瑩,張 玲,賈慶勝
(1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江 哈爾濱 150076;2.哈爾濱商業(yè)大學中式快餐研究發(fā)展中心博士后科研基地,黑龍江 哈爾濱 150076;3.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院,黑龍江 大慶 163319;4.黑龍江生物科技職業(yè)學院,黑龍江 哈爾濱 150025;5.黑龍江北大荒豐緣麥業(yè)集團有限公司,黑龍江 哈爾濱 150076)
黑龍江小麥麥胚多肽的制備及抗氧化功能研究Ⅱ.超濾法精制抗氧化麥胚多肽工藝條件的優(yōu)化
張洪微1,2,3,楊銘鐸1,2,*,吳瑩瑩1,2,張 玲4,賈慶勝5
(1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江 哈爾濱 150076;2.哈爾濱商業(yè)大學中式快餐研究發(fā)展中心博士后科研基地,黑龍江 哈爾濱 150076;3.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院,黑龍江 大慶 163319;4.黑龍江生物科技職業(yè)學院,黑龍江 哈爾濱 150025;5.黑龍江北大荒豐緣麥業(yè)集團有限公司,黑龍江 哈爾濱 150076)
采用3ku和6ku的超濾膜對麥胚多肽進行分級分離,考察3種分離產(chǎn)物對DPPH·的清除能力,發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在3ku以下的麥胚多肽對DPPH·的清除率可達75.32%,高于其他分離產(chǎn)物。采用響應面試驗方法對麥胚多肽的超濾條件進行優(yōu)化試驗,結果表明,最佳超濾條件為超濾壓力0.08MPa、超濾時間23min、超濾pH6.83、溶液質(zhì)量分數(shù)2%,此時膜通量為4.85L/(m2·h)。所得分子質(zhì)量小于3ku的麥胚多肽在質(zhì)量分數(shù)11%時,其DPPH·清除率為78.93%。超濾法精制的麥胚多肽具有良好的DPPH·的清除能力。
麥胚多肽;DPPH·清除作用;超濾法
小麥胚芽因含有豐富的蛋白質(zhì)、油脂、碳水化合物、維生素等人體需要的營養(yǎng)素及谷胱甘肽、黃酮類物質(zhì)和二十八烷醇等生理活性物質(zhì)而被營養(yǎng)學家譽為“人類天然營養(yǎng)寶庫和人類的生命資源”[1-2]。小麥胚芽中的蛋白質(zhì)含量高達30%,而且氨基酸比例合理,是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源[3]。麥胚蛋白在酶的作用下多肽鏈被打斷,釋放各種肽類化合物,使其功能性質(zhì)得到改善,并具有一定的生物活性。有研究表明[4],小麥蛋白經(jīng)過水解后的多肽具有抗氧化活性,多肽的抗氧化活性還同分子質(zhì)量有關[5-6]。
超濾技術是在0.05~0.1MPa的靜壓差推動下,截留蛋白質(zhì)、酶等相對分子質(zhì)量大于500u的大分子及膠體,形成濃縮液,達到溶液的凈化、分離及濃縮目的[7]。采用超濾技術對酶解后的麥胚多肽進行分級分離,可以得到具有較高抗氧化活性的多肽產(chǎn)品[8]。本實驗對麥胚蛋白的酶解產(chǎn)物進行超濾,得到具有較高DPPH·清除能力的麥胚多肽,并采用響應面分析方法對超濾條件進行優(yōu)化,為麥胚多肽的生產(chǎn)提供一定參考。
1.1 材料與試劑
小麥胚芽 黑龍江北大荒豐源麥業(yè);堿性蛋白酶Alcalase F G、木瓜蛋白酶 諾維信酶制劑公司;DPPH· (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 日本W(wǎng)ako公司。
1.2 儀器與設備
3、6ku圓片平板聚醚砜超濾膜、MSC300型杯式超濾器 上海摩速科學器材有限公司;R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術有限公司;ZDO-2型真空冷凍干燥箱 寧夏亞麻技術設備有限公司。
1.3 方法
1.3.1 麥胚多肽的制備工藝流程
小麥胚芽→粉碎→過100目篩→脫脂→堿提(pH 10.0)→酸沉(pH4.0) →離心→棄上清液→冷凍干燥→麥胚蛋白粉→酶解→麥胚蛋白酶解物→超濾→冷凍干燥→麥胚多肽
1.3.2 清除DPPH·能力的測定
取一定濃度的樣品1mL,加入1×10-4mol/L DPPH·無水乙醇溶液1mL,混均后在室溫避光保存30min,在517nm波長條件下測定吸光度,空白組以等體積無水乙醇溶液代替DPPH·溶液,對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液,并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零,所有測定值均為3次結果的平均值,清除率計算[9]公式如下:
式中:A0為對照組吸光度;Ai為樣品組吸光度;Aj為空白組吸光度。
1.3.3 膜通量的確定式中:V為透過液的體積/L;S為膜的有效面積/ m2;t為運轉(zhuǎn)時間/h;L為膜通量/(L/(m2·h))。1.4試驗設計
1.4.1 超濾膜的選擇
將麥胚蛋白酶解物依次通過6ku和3ku的超濾膜,將麥胚蛋白酶解物分級為<3、3~6、>6ku,將分級后的麥胚多肽水溶液進行冷凍干燥,測其對DPPH·清除效果,選擇抗氧化效果最好的組分進行超濾條件的確定。
1.4.2 超濾條件的優(yōu)化
1.4.2.1 單因素試驗
超濾時膜通量的大小主要受超濾壓力、超濾時間、pH值和溶液質(zhì)量分數(shù)的影響,因此選擇以上4個因素進行超濾條件優(yōu)化的單因素試驗,試驗水平設計見表1。
1.4.2.2 響應曲面法對超濾條件的優(yōu)化
根據(jù)單因素試驗結果,采用Box-behnken試驗設計方法對超濾條件進行優(yōu)化,選取超濾壓力、超濾時間、pH值、溶液質(zhì)量分數(shù)4個因素為自變量,以膜通量為響應值,因素水平見表1。
表1 響應曲面分析因素水平設計表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in the response surface analysis
2.1 超濾膜的選擇結果分析
圖1 不同分子質(zhì)量范圍的麥胚多肽對DPPH·清除率的影響Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of wheat germ peptides with different molecular weights
由圖1可知,經(jīng)過分級后的麥胚多肽,其清除DPPH·的能力有所不同。隨著麥胚多肽分子質(zhì)量的降低,其清除DPPH·的能力逐步提高,當分子質(zhì)量在3ku以下時,其清除能力達到75.32%,比6ku以上的麥胚多肽清除能力提高了17.74%。這是因為經(jīng)過3ku膜超濾處理的麥胚多肽,除去了大部分的大分子蛋白,使得其疏水性氨基酸含量大大增加,而這些疏水氨基酸對體外抗氧化有著很好的效果。此結論與大豆多肽[10]、雞胚多肽[11]、雞骨膠原蛋白肽[12]結論相同。
2.2 超濾條件優(yōu)化的結果分析
2.2.1 超濾壓力對膜通量的影響
圖2 超濾壓力對膜通量的影響Fig.2 Effect of pressure on membrane flux
由圖2可以看出,隨著超濾壓力的增加,膜通量呈上升趨勢,超濾壓力由0.05MPa上升到0.07MPa過程中,膜通量上升迅速,而由0.07MPa上升到0.09MPa時,膜通量趨于平穩(wěn)。這是因為,超濾壓力增大的初期,隨著超濾壓力的增加,膜兩側的壓力逐步加大,使得膜通量迅速增加;當超濾壓力繼續(xù)增加時,會很快造成濃差極化現(xiàn)象,而當壓力過大時,反而會造成組分中物質(zhì)的沉積,造成膜通量下降[13]。因此,超濾壓力的選擇不宜過大,本試驗中,選擇0.07MPa作為單因素試驗中的最佳超濾壓力。
2.2.2 超濾時間對膜通量的影響
圖3 超濾時間對膜通量的影響Fig.3 Effect of time on membrane flux
由圖3可以看出,隨著超濾時間的增加,膜通量呈下降趨勢,在20~30min內(nèi),膜通量下降緩慢,在40~50min時,膜通量下降迅速。這是因為,當超濾時間增加時,造成溶液中組分沉積,濃差極化現(xiàn)象嚴重,因此,選擇適當?shù)墓ぷ髦芷?,可以有效地防止膜通量下降,本試驗選擇30min作為一個工作周期。
2.2.3 超濾pH值對膜通量的影響
麥胚蛋白在pH4時達到等電點,在等電點時,未被酶解的蛋白從溶液中沉淀出來,會造成超濾膜的堵塞,膜通量下降,隨著pH值向中性偏移,溶液中的麥胚蛋白不再析出,膜通量上升,而當pH值過高時,堿性環(huán)境會造成蛋白的變性[14],溶液黏度增加,反而不利于超濾的進行。因此,選擇pH7作為超濾單因素試驗中的最佳pH值。
圖4 pH值對膜通量的影響Fig.4 Effect of pH on membrane flux
2.2.4 溶液質(zhì)量分數(shù)對膜通量的影響
圖5 溶液質(zhì)量分數(shù)對膜通量的影響Fig.5 Effect of wheat germ hydrolysate concentration on membrane flux
由圖5可以看出,隨著溶液質(zhì)量分數(shù)的增加,超濾的膜通量逐漸下降,這是因為溶液質(zhì)量分數(shù)越大,超濾時會造成過多的組分沉積在超濾膜上,影響超濾效果。但是,過小的質(zhì)量分數(shù),會造成超濾過程中的實際膜效能降低[15],增加后期冷凍干燥的工作量,因此超濾單因素試驗中的最佳質(zhì)量分數(shù)為3%。
2.2.5 響應曲面法對超濾條件的優(yōu)化
2.2.5.1 響應曲面試驗設計及結果(見表3)
2.2.5.2 響應曲面試驗結果分析
應用Design expert 7.0統(tǒng)計分析軟件對表3試驗結果進行分析,得到回歸方程為:
Y=4.7-0.078A+0.017B+0.1C+2.5×10-3D-0.028AB-0.1AC-0.03AD-0.02BC+0.068BD+0.06CD+0.02A2-0.051B2-0.13C2-0.013D2
對所得數(shù)據(jù)進行方差分析,得到結果見表3。由表3可知,模型項、A、AC影響顯著,C、C2影響極顯著,失擬項不顯著。說明模型的擬合性良好,可以用于模型分析。決定系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為0.7765和0.5531,說明該模型的擬合性良好,可以用于模型分析。本模型的信噪比為7.539,說明該模型可以用于生產(chǎn)應用當中。
表3 麥胚蛋白酶解物超濾條件優(yōu)化響應曲面試驗設計及結果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis
由于AC影響顯著,作響應面圖見圖6。由圖6可以看出,隨著超濾壓力的增大,超濾膜通量呈逐漸增加的趨勢,在超濾壓力達到0.08MPa時,膜通量達到4.72L/(m2·h);而超濾膜通量隨pH值的變化先增大后減小,這是因為麥胚蛋白酶解物在酸性環(huán)境中,由于接近其等電點,會造成沉積物析出,而當其處于堿性環(huán)境中時,又會造成蛋白的變性。因此,選擇中性的pH值超濾效果最好。
通過對回歸方程的分析,得到超濾條件的優(yōu)化結果為超濾壓力0.08MPa、超濾時間22.68min、超濾pH6.83、溶液質(zhì)量分數(shù)2.00%。
表4 響應曲面方差分析表Table 4 Variance analysis of the established regression model
圖6 超濾壓力與超濾pH值交互作用的等高線與響應曲面圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pressure and pH on membrane flux
2.3 驗證實驗
根據(jù)響應面分析結果進行驗證實驗,但在超濾時間的選擇上考慮實驗的可操作性,將最佳的超濾時間修正為23min。在此條件下,膜通量可達到4.85L/(m2·h),較為理想。同時對超濾精制后的麥胚多肽進行DPPH·清除能力的測定,實驗發(fā)現(xiàn),精制后的麥胚多肽其DPPH·清除能力較高,質(zhì)量分數(shù)11%的麥胚多肽溶液對DPPH·清除率達到78.93%,說明麥胚多肽有較強的清除DPPH·的能力。
3.1 分級分離后的麥胚多肽,其抗氧化性能有所不同,其中分子質(zhì)量在3ku以下的麥胚多肽組分抗氧化活性最高,其DPPH·清除能力可達到75.32%。
3.2 通過單因素及響應曲面法對3ku以下的麥胚多肽超濾條件進行優(yōu)化,得到最佳超濾條件為超濾壓力0.08MPa、超濾時間23min、超濾pH6.83、溶液質(zhì)量分數(shù)2%,此時膜通量為4.85L/(m2·h)。
3.3 精制后的麥胚多肽具有較好的DPPH·清除能力,麥胚多肽質(zhì)量分數(shù)為11%時,其DPPH·清除率達78.93%。
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Preparation and Antioxidant Activity of Germ Peptides from Helongjiang Wheat Ⅱ∶ Optimization of Ultra-filtration Separation of Wheat Germ Peptides
ZHANG Hong-wei1,2,3,YANG Ming-duo1,2,*,WU Ying-ying1,2,ZHANG Ling4,JIA Qing-sheng5
(1. Institute of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China;2. Postdoctoral Research Base of the Chinese Fast Food Research and Development Center, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China;3. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China;4. Heilongjiang Vocational College of Biology Scienece and Technology, Harbin 150025, China;5. Heilongjiang Beidahuang Fengyuan Wheat Industry Group Co. Ltd., Harbin 150076, China)
Wheat germ protein hydrolysate prepared by enzymatic hydrolysis was separated with ultra-filtration membranes with a molecular weight cutoff (MWCO) of 3 ku and 6 ku, respectively. Four ultra-filtration parameters such as pressure, time, pH and sample concentration were optimized by response surface methodology to be 0.08 MPa, 23 min, 6.83 and 2%, respectively. Under these conditions, the ultra-filtration membrane flux of was 4.85 L/(m2·h). The obtained fraction of less than 3 ku in molecular weight exhibited a DPPH free radical scavenging rate of 78.93% at the concentration of 11%.
wheat germ peptide;DPPH free radical scavenging activity;ultra-filtration
TS210.9
A
1002-6630(2011)14-0171-05
2010-12-17
黑龍江省自然科學基金項目(C201041)
張洪微(1975—),女,講師,碩士,研究方向為食品科學。E-mail:fcwei_2004@126.com
*通信作者:楊銘鐸(1956—),男,教授,博士,研究方向為傳統(tǒng)食品工業(yè)化。E-mail:yangmingduo5663@163.com