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        黑龍江小麥麥胚多肽的制備及抗氧化功能研究Ⅱ.超濾法精制抗氧化麥胚多肽工藝條件的優(yōu)化

        2011-04-06 09:40:39張洪微楊銘鐸吳瑩瑩賈慶勝
        食品科學(xué) 2011年14期
        關(guān)鍵詞:多肽通量哈爾濱

        張洪微,楊銘鐸,吳瑩瑩,張 玲,賈慶勝

        (1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150076;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)中式快餐研究發(fā)展中心博士后科研基地,黑龍江 哈爾濱 150076;3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 大慶 163319;4.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150025;5.黑龍江北大荒豐緣麥業(yè)集團(tuán)有限公司,黑龍江 哈爾濱 150076)

        黑龍江小麥麥胚多肽的制備及抗氧化功能研究Ⅱ.超濾法精制抗氧化麥胚多肽工藝條件的優(yōu)化

        張洪微1,2,3,楊銘鐸1,2,*,吳瑩瑩1,2,張 玲4,賈慶勝5

        (1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150076;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)中式快餐研究發(fā)展中心博士后科研基地,黑龍江 哈爾濱 150076;3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 大慶 163319;4.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150025;5.黑龍江北大荒豐緣麥業(yè)集團(tuán)有限公司,黑龍江 哈爾濱 150076)

        采用3ku和6ku的超濾膜對(duì)麥胚多肽進(jìn)行分級(jí)分離,考察3種分離產(chǎn)物對(duì)DPPH·的清除能力,發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在3ku以下的麥胚多肽對(duì)DPPH·的清除率可達(dá)75.32%,高于其他分離產(chǎn)物。采用響應(yīng)面試驗(yàn)方法對(duì)麥胚多肽的超濾條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn),結(jié)果表明,最佳超濾條件為超濾壓力0.08MPa、超濾時(shí)間23min、超濾pH6.83、溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,此時(shí)膜通量為4.85L/(m2·h)。所得分子質(zhì)量小于3ku的麥胚多肽在質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%時(shí),其DPPH·清除率為78.93%。超濾法精制的麥胚多肽具有良好的DPPH·的清除能力。

        麥胚多肽;DPPH·清除作用;超濾法

        小麥胚芽因含有豐富的蛋白質(zhì)、油脂、碳水化合物、維生素等人體需要的營(yíng)養(yǎng)素及谷胱甘肽、黃酮類物質(zhì)和二十八烷醇等生理活性物質(zhì)而被營(yíng)養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為“人類天然營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)和人類的生命資源”[1-2]。小麥胚芽中的蛋白質(zhì)含量高達(dá)30%,而且氨基酸比例合理,是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源[3]。麥胚蛋白在酶的作用下多肽鏈被打斷,釋放各種肽類化合物,使其功能性質(zhì)得到改善,并具有一定的生物活性。有研究表明[4],小麥蛋白經(jīng)過水解后的多肽具有抗氧化活性,多肽的抗氧化活性還同分子質(zhì)量有關(guān)[5-6]。

        超濾技術(shù)是在0.05~0.1MPa的靜壓差推動(dòng)下,截留蛋白質(zhì)、酶等相對(duì)分子質(zhì)量大于500u的大分子及膠體,形成濃縮液,達(dá)到溶液的凈化、分離及濃縮目的[7]。采用超濾技術(shù)對(duì)酶解后的麥胚多肽進(jìn)行分級(jí)分離,可以得到具有較高抗氧化活性的多肽產(chǎn)品[8]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)麥胚蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾,得到具有較高DPPH·清除能力的麥胚多肽,并采用響應(yīng)面分析方法對(duì)超濾條件進(jìn)行優(yōu)化,為麥胚多肽的生產(chǎn)提供一定參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        小麥胚芽 黑龍江北大荒豐源麥業(yè);堿性蛋白酶Alcalase F G、木瓜蛋白酶 諾維信酶制劑公司;DPPH· (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 日本W(wǎng)ako公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        3、6ku圓片平板聚醚砜超濾膜、MSC300型杯式超濾器 上海摩速科學(xué)器材有限公司;R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司;ZDO-2型真空冷凍干燥箱 寧夏亞麻技術(shù)設(shè)備有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 麥胚多肽的制備工藝流程

        小麥胚芽→粉碎→過100目篩→脫脂→堿提(pH 10.0)→酸沉(pH4.0) →離心→棄上清液→冷凍干燥→麥胚蛋白粉→酶解→麥胚蛋白酶解物→超濾→冷凍干燥→麥胚多肽

        1.3.2 清除DPPH·能力的測(cè)定

        取一定濃度的樣品1mL,加入1×10-4mol/L DPPH·無水乙醇溶液1mL,混均后在室溫避光保存30min,在517nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度,空白組以等體積無水乙醇溶液代替DPPH·溶液,對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液,并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零,所有測(cè)定值均為3次結(jié)果的平均值,清除率計(jì)算[9]公式如下:

        式中:A0為對(duì)照組吸光度;Ai為樣品組吸光度;Aj為空白組吸光度。

        1.3.3 膜通量的確定式中:V為透過液的體積/L;S為膜的有效面積/ m2;t為運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間/h;L為膜通量/(L/(m2·h))。1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        1.4.1 超濾膜的選擇

        將麥胚蛋白酶解物依次通過6ku和3ku的超濾膜,將麥胚蛋白酶解物分級(jí)為<3、3~6、>6ku,將分級(jí)后的麥胚多肽水溶液進(jìn)行冷凍干燥,測(cè)其對(duì)DPPH·清除效果,選擇抗氧化效果最好的組分進(jìn)行超濾條件的確定。

        1.4.2 超濾條件的優(yōu)化

        1.4.2.1 單因素試驗(yàn)

        超濾時(shí)膜通量的大小主要受超濾壓力、超濾時(shí)間、pH值和溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響,因此選擇以上4個(gè)因素進(jìn)行超濾條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn),試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表1。

        1.4.2.2 響應(yīng)曲面法對(duì)超濾條件的優(yōu)化

        根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)超濾條件進(jìn)行優(yōu)化,選取超濾壓力、超濾時(shí)間、pH值、溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4個(gè)因素為自變量,以膜通量為響應(yīng)值,因素水平見表1。

        表1 響應(yīng)曲面分析因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in the response surface analysis

        2 結(jié)果與分析

        2.1 超濾膜的選擇結(jié)果分析

        圖1 不同分子質(zhì)量范圍的麥胚多肽對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of wheat germ peptides with different molecular weights

        由圖1可知,經(jīng)過分級(jí)后的麥胚多肽,其清除DPPH·的能力有所不同。隨著麥胚多肽分子質(zhì)量的降低,其清除DPPH·的能力逐步提高,當(dāng)分子質(zhì)量在3ku以下時(shí),其清除能力達(dá)到75.32%,比6ku以上的麥胚多肽清除能力提高了17.74%。這是因?yàn)榻?jīng)過3ku膜超濾處理的麥胚多肽,除去了大部分的大分子蛋白,使得其疏水性氨基酸含量大大增加,而這些疏水氨基酸對(duì)體外抗氧化有著很好的效果。此結(jié)論與大豆多肽[10]、雞胚多肽[11]、雞骨膠原蛋白肽[12]結(jié)論相同。

        2.2 超濾條件優(yōu)化的結(jié)果分析

        2.2.1 超濾壓力對(duì)膜通量的影響

        圖2 超濾壓力對(duì)膜通量的影響Fig.2 Effect of pressure on membrane flux

        由圖2可以看出,隨著超濾壓力的增加,膜通量呈上升趨勢(shì),超濾壓力由0.05MPa上升到0.07MPa過程中,膜通量上升迅速,而由0.07MPa上升到0.09MPa時(shí),膜通量趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)?,超濾壓力增大的初期,隨著超濾壓力的增加,膜兩側(cè)的壓力逐步加大,使得膜通量迅速增加;當(dāng)超濾壓力繼續(xù)增加時(shí),會(huì)很快造成濃差極化現(xiàn)象,而當(dāng)壓力過大時(shí),反而會(huì)造成組分中物質(zhì)的沉積,造成膜通量下降[13]。因此,超濾壓力的選擇不宜過大,本試驗(yàn)中,選擇0.07MPa作為單因素試驗(yàn)中的最佳超濾壓力。

        2.2.2 超濾時(shí)間對(duì)膜通量的影響

        圖3 超濾時(shí)間對(duì)膜通量的影響Fig.3 Effect of time on membrane flux

        由圖3可以看出,隨著超濾時(shí)間的增加,膜通量呈下降趨勢(shì),在20~30min內(nèi),膜通量下降緩慢,在40~50min時(shí),膜通量下降迅速。這是因?yàn)?,?dāng)超濾時(shí)間增加時(shí),造成溶液中組分沉積,濃差極化現(xiàn)象嚴(yán)重,因此,選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ髦芷冢梢杂行У胤乐鼓ね肯陆?,本試?yàn)選擇30min作為一個(gè)工作周期。

        2.2.3 超濾pH值對(duì)膜通量的影響

        麥胚蛋白在pH4時(shí)達(dá)到等電點(diǎn),在等電點(diǎn)時(shí),未被酶解的蛋白從溶液中沉淀出來,會(huì)造成超濾膜的堵塞,膜通量下降,隨著pH值向中性偏移,溶液中的麥胚蛋白不再析出,膜通量上升,而當(dāng)pH值過高時(shí),堿性環(huán)境會(huì)造成蛋白的變性[14],溶液黏度增加,反而不利于超濾的進(jìn)行。因此,選擇pH7作為超濾單因素試驗(yàn)中的最佳pH值。

        圖4 pH值對(duì)膜通量的影響Fig.4 Effect of pH on membrane flux

        2.2.4 溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膜通量的影響

        圖5 溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膜通量的影響Fig.5 Effect of wheat germ hydrolysate concentration on membrane flux

        由圖5可以看出,隨著溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,超濾的膜通量逐漸下降,這是因?yàn)槿芤嘿|(zhì)量分?jǐn)?shù)越大,超濾時(shí)會(huì)造成過多的組分沉積在超濾膜上,影響超濾效果。但是,過小的質(zhì)量分?jǐn)?shù),會(huì)造成超濾過程中的實(shí)際膜效能降低[15],增加后期冷凍干燥的工作量,因此超濾單因素試驗(yàn)中的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%。

        2.2.5 響應(yīng)曲面法對(duì)超濾條件的優(yōu)化

        2.2.5.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(見表3)

        2.2.5.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果分析

        應(yīng)用Design expert 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得到回歸方程為:

        Y=4.7-0.078A+0.017B+0.1C+2.5×10-3D-0.028AB-0.1AC-0.03AD-0.02BC+0.068BD+0.06CD+0.02A2-0.051B2-0.13C2-0.013D2

        對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,得到結(jié)果見表3。由表3可知,模型項(xiàng)、A、AC影響顯著,C、C2影響極顯著,失擬項(xiàng)不顯著。說明模型的擬合性良好,可以用于模型分析。決定系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為0.7765和0.5531,說明該模型的擬合性良好,可以用于模型分析。本模型的信噪比為7.539,說明該模型可以用于生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中。

        表3 麥胚蛋白酶解物超濾條件優(yōu)化響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

        由于AC影響顯著,作響應(yīng)面圖見圖6。由圖6可以看出,隨著超濾壓力的增大,超濾膜通量呈逐漸增加的趨勢(shì),在超濾壓力達(dá)到0.08MPa時(shí),膜通量達(dá)到4.72L/(m2·h);而超濾膜通量隨pH值的變化先增大后減小,這是因?yàn)辂溑叩鞍酌附馕镌谒嵝原h(huán)境中,由于接近其等電點(diǎn),會(huì)造成沉積物析出,而當(dāng)其處于堿性環(huán)境中時(shí),又會(huì)造成蛋白的變性。因此,選擇中性的pH值超濾效果最好。

        通過對(duì)回歸方程的分析,得到超濾條件的優(yōu)化結(jié)果為超濾壓力0.08MPa、超濾時(shí)間22.68min、超濾pH6.83、溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.00%。

        表4 響應(yīng)曲面方差分析表Table 4 Variance analysis of the established regression model

        圖6 超濾壓力與超濾pH值交互作用的等高線與響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pressure and pH on membrane flux

        2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

        根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),但在超濾時(shí)間的選擇上考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性,將最佳的超濾時(shí)間修正為23min。在此條件下,膜通量可達(dá)到4.85L/(m2·h),較為理想。同時(shí)對(duì)超濾精制后的麥胚多肽進(jìn)行DPPH·清除能力的測(cè)定,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),精制后的麥胚多肽其DPPH·清除能力較高,質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%的麥胚多肽溶液對(duì)DPPH·清除率達(dá)到78.93%,說明麥胚多肽有較強(qiáng)的清除DPPH·的能力。

        3 結(jié) 論

        3.1 分級(jí)分離后的麥胚多肽,其抗氧化性能有所不同,其中分子質(zhì)量在3ku以下的麥胚多肽組分抗氧化活性最高,其DPPH·清除能力可達(dá)到75.32%。

        3.2 通過單因素及響應(yīng)曲面法對(duì)3ku以下的麥胚多肽超濾條件進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳超濾條件為超濾壓力0.08MPa、超濾時(shí)間23min、超濾pH6.83、溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,此時(shí)膜通量為4.85L/(m2·h)。

        3.3 精制后的麥胚多肽具有較好的DPPH·清除能力,麥胚多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%時(shí),其DPPH·清除率達(dá)78.93%。

        [1]周惠明, 朱科學(xué). 小麥胚中谷胱甘肽的純化與富集的研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2003, 18(1)∶ 20-23.

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        Preparation and Antioxidant Activity of Germ Peptides from Helongjiang Wheat Ⅱ∶ Optimization of Ultra-filtration Separation of Wheat Germ Peptides

        ZHANG Hong-wei1,2,3,YANG Ming-duo1,2,*,WU Ying-ying1,2,ZHANG Ling4,JIA Qing-sheng5
        (1. Institute of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China;2. Postdoctoral Research Base of the Chinese Fast Food Research and Development Center, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China;3. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China;4. Heilongjiang Vocational College of Biology Scienece and Technology, Harbin 150025, China;5. Heilongjiang Beidahuang Fengyuan Wheat Industry Group Co. Ltd., Harbin 150076, China)

        Wheat germ protein hydrolysate prepared by enzymatic hydrolysis was separated with ultra-filtration membranes with a molecular weight cutoff (MWCO) of 3 ku and 6 ku, respectively. Four ultra-filtration parameters such as pressure, time, pH and sample concentration were optimized by response surface methodology to be 0.08 MPa, 23 min, 6.83 and 2%, respectively. Under these conditions, the ultra-filtration membrane flux of was 4.85 L/(m2·h). The obtained fraction of less than 3 ku in molecular weight exhibited a DPPH free radical scavenging rate of 78.93% at the concentration of 11%.

        wheat germ peptide;DPPH free radical scavenging activity;ultra-filtration

        TS210.9

        A

        1002-6630(2011)14-0171-05

        2010-12-17

        黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201041)

        張洪微(1975—),女,講師,碩士,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail:fcwei_2004@126.com

        *通信作者:楊銘鐸(1956—),男,教授,博士,研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)食品工業(yè)化。E-mail:yangmingduo5663@163.com

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