伍善廣，賴泰君，孫建華，劉旭輝,3，童張法，廖丹葵,*

(1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2.柳州醫(yī)學高等?？茖W校， 廣西 柳州 545006；3.河池學院化學與生命科學系，廣西 宜州 546300)

蠶蛹多糖脫蛋白方法研究

伍善廣1,2，賴泰君1，孫建華1，劉旭輝1,3，童張法1，廖丹葵1,*

(1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2.柳州醫(yī)學高等?？茖W校， 廣西 柳州 545006；3.河池學院化學與生命科學系，廣西 宜州 546300)

以蛋白去除率和多糖損失率為指標，比較Sevag法、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法和木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫除蠶蛹多糖蛋白的效果。結果顯示：木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用效果最好，其脫蛋白的最佳條件為木瓜蛋白酶用量[E]/[S] 2.0%、酶解溫度50℃、酶解反應1.5h、采用TCA法除蛋白1次，此時蛋白去除率為97.98%，多糖損失率為18.76%；紫外光譜掃描定性實驗顯示脫蛋白的多糖在260～280nm處只有少量吸收，表明大多數(shù)蛋白已去除。木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法是一種有效的多糖脫蛋白方法。

蠶蛹；多糖；蛋白；脫除

近年來，多糖所具有的各種生理功能逐漸為人們所重視，如增強免疫力、降低血糖濃度、降血脂、抗腫瘤、抗疲勞及抗衰老等[1-6]。多糖具有的生理功能與其結構密切相關，從天然動植物提取的多糖，往往含有大量的蛋白質，蛋白的存在不僅可能影響其結構和生物活性的研究，且可能導致藥理作用下降。因此，在天然多糖的提取、分離純化及結構研究中，脫蛋白是一個重要的環(huán)節(jié)。由于多糖常常與蛋白形成糖蛋白復合物，使蛋白質的脫除比較困難[7]。國內外對粗多糖脫蛋白方法研究較多的有三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)法、Savag法和酶法等[8-10]。以往研究發(fā)現(xiàn)TCA法脫蛋白時多糖損失較大[11]，Sevag法需要反復多次使用，且可能導致部分多糖水解[12]。采用化學法與酶法聯(lián)用，由于酶可以使大部分的游離蛋白質和部分結合蛋白水解，減少了后續(xù)有機溶劑除蛋白的次數(shù)，從而降低了多糖隨凝膠物沉淀而損失的可能，可以獲得較好的效果[13]。

蠶蛹(silkworm pupa)為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾(Bombyχ moil L.)的蛹[14]，為藥膳同源傳統(tǒng)中藥材，具有很高的營養(yǎng)和藥用價值。蠶蛹多糖是蠶蛹中的主要活性成分之一，藥理實驗表明，蠶蛹多糖具有明顯增強機體免疫功能的作用[15-18]。本實驗室對水提醇沉法提取蠶蛹多糖的工藝進行研究[19]，但該方法所獲得的蠶蛹粗多糖中含有一定量的蛋白質?；诓煌摰鞍追椒ǖ奶攸c，本實驗分別采用Sevag法、三氯乙酸法(TCA法)、酶法以及兩法聯(lián)用進行脫蛋白研究，考察脫蛋白工藝，以確定適于蠶蛹多糖脫蛋白的方法，為進一步分離純化蠶蛹多糖提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蠶蛹粗多糖(多糖含量為質量百分比16.9%) 自制；牛血清蛋白 美國Sigma公司；木瓜蛋白酶(酶活為36萬U/g) 南寧市龐博生物技術公司；其他試劑為分析純。

BS110S型分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司；H-1650型高速離心機 長沙湘儀離心機有限公司；UV-2102P型紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。1.2脫蛋白實驗

1.2.1 Sevag法脫蛋白

取1g/100mL粗多糖溶液50mL，加入其體積1/5的Sevag試劑(V正丁醇∶V氯仿，1/5)，劇烈振搖20min，4000r/min離心，取出部分上層水溶液，得第1次脫蛋白多糖溶液，水溶液重復上述操作。取5份樣品，用上述步驟分別處理1、2、3、4、5次，測定不同處理次數(shù)蛋白去除率和多糖損失率。

1.2.2 三氯乙酸法(TCA法)脫蛋白

取1g/100mL粗多糖溶液50mL，分別加入等體積TCA溶液使其體積分數(shù)分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，90r/min振蕩20min，靜置1h，4000r/min離心15min并棄去沉淀。確定脫蛋白效果最好的TCA體積分數(shù)后，考察TCA法不同脫蛋白次數(shù)的效果。

1.2.3 木瓜蛋白酶法脫蛋白

取5管1g/100mL粗多糖溶液(50mL/管，下同)放入37℃水浴鍋中預熱10min，加入蛋白酶在一定溫度下酶解一定時間，反應結束后將反應瓶放入100℃沸水浴中滅酶10min，冷卻至室溫，測定溶液中蛋白含量和多糖含量。采用單因素試驗法，分別考察蛋白酶加入量([E]/ [S])、酶解溫度以及酶解時間對蠶蛹多糖的脫蛋白的影響，以獲得最佳酶法脫蛋白條件。

1.2.4 木瓜蛋白酶法與Sevag法聯(lián)用脫蛋白

將1g/100mL粗多糖溶液50mL于37℃水浴鍋中預熱10min，按1.2.3節(jié)得到的木瓜蛋白酶脫蛋白最優(yōu)條件進行脫蛋白實驗，再按1.2.1節(jié)Sevag法脫蛋白所述實驗條件脫蛋白1次后，上層水溶液即為木瓜蛋白酶法-Sevag法聯(lián)用脫蛋白多糖溶液。

1.2.5 木瓜蛋白酶法與TCA法聯(lián)用脫蛋白

取1g/100mL粗多糖溶液50mL，于37℃水浴鍋中預熱10min，按1.2.3節(jié)得到的木瓜蛋白酶脫蛋白最優(yōu)條件進行脫蛋白實驗，再用1.3.2節(jié)TCA法脫蛋白最優(yōu)條件處理1次，溶液經4000r/min離心15min棄去沉淀，即得木瓜蛋白酶法-TCA法聯(lián)用脫蛋白多糖溶液。

1.3 蛋白質及多糖含量測定方法

1.3.1 蛋白質含量的測定

蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法[20]，用牛血清蛋白作標準曲線，牛血清白蛋白質量濃度C與吸光度A之間的回歸方程為A=0.005C＋0.0362(r=0.9984)，線性范圍20.0～100.0μg/mL。

1.3.2 多糖含量的測定

蠶蛹多糖含量的測定采用苯酚-硫酸比色法[9]，用葡萄糖作標準曲線，總糖質量濃度C與吸光度A之間的回歸方程為A=13.414C＋0.0063(r=0.9988)，線性范圍為0.01～0.06mg/mL。

稱取粗多糖配制成含量約為1g/100mL的溶液，按照上述各脫蛋白方法進行脫蛋白處理，并將處理后所得溶液真空干燥至質量恒定，分別測定蛋白質及多糖含量，按下式計算蛋白去除率和多糖損失率。

式中：Ri為粗多糖中蛋白質量/g；Rj為除蛋白處理后樣品中蛋白質量/g。

式中：Ti為粗多糖中多糖質量/g；Tj為除蛋白處理后樣品中多糖質量/g。

1.4 蠶蛹多糖除蛋白質方法的定性分析

分別稱取原料粗多糖、最優(yōu)脫蛋白方法制備得到的蠶蛹多糖各100mg，用蒸餾水溶解定容至50mL，對溶液進行紫外光譜掃描。

2 結果與分析

2.1 Sevag法脫蛋白效果

由圖1可知，蛋白去除率隨著脫蛋白次數(shù)增加而上升，而多糖損失率則變化不大，其中Sevag法處理5次后，蛋白質去除率為30.20%、多糖損失率為10.14%，即大部分蛋白仍與多糖結合未能去除。

圖1 Sevag法脫除蠶蛹多糖蛋白質的效果Fig.1 Effect of number of Sevag deproteinizations on protein removal rate and polysaccharide loss rate

2.2 三氯乙酸法(TCA法)脫蛋白效果

圖2 三氯乙酸(TCA)法脫蛋白效果Fig.2 Effect of TCA concentration and number of deproteinizations on protein removal rate and polysaccharide loss rate

由圖2A可看出，隨著TCA體積分數(shù)的增加，蛋白去除率升高先后降低，當TCA體積分數(shù)為3.0%時脫蛋白效果最好，蛋白去除率為59.41%、多糖損失率為5.14%。由圖2B可以看出，蛋白去除率和多糖損失率均隨著脫蛋白次數(shù)增加而增大，脫蛋白2次蛋白去除率達75.52%，但多糖損失率則達18.61%。脫蛋白3次時蛋白脫除率達80.66%、多糖損失率為22.84%。

2.3 木瓜蛋白酶法脫蛋白效果

由圖3可知，粗多糖蛋白質去除率隨著酶用量的增加而增加，但當酶用量[E]/[S]超過2.0%后，蛋白質去除率增加不明顯；隨著酶解溫度的升高，蛋白質去除率則表現(xiàn)為先升后降，酶解溫度50℃時蛋白質去除率最高；隨著酶解時間延長蛋白質去除率增大，當酶解1.5h后蛋白脫除率變化不明顯。

綜上所述，木瓜蛋白酶脫蛋白的最佳工藝條件為酶用量[E]/[S] 2.0%、酶解溫度50℃、酶解反應時間1.5h，此時蛋白質去除率為80.52%，多糖損失率為9.94%。

圖3 木瓜蛋白酶法去蛋白效果Fig.3 Effect of papain dosage, hydrolysis temperature and hydrolysis time on protein removal rate and polysaccharide loss rate

2.4 各種方法脫蛋白效果比較

圖4 各種脫蛋白方法的結果比較Fig.4 Comparisons of protein removal rates and polysaccharide loss rates obtained by different deproteinization methods

各取1g/100mL粗多糖溶液50mL，分別用Sevag法(處理5次)、三氯乙酸法(處理3次)、木瓜蛋白酶法(酶法)、木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法(酶-Sevag法，其中Sevag法處理3次)和木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法(酶-TCA法，其中TCA法處理1次)進行脫蛋白處理，結果見圖4?？梢钥闯?，木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法蛋白去除率最高，而Sevag法蛋白去除率最低。采用傳統(tǒng)Sevag法對粗多糖進行5次處理后，雖然多糖損失率只有10.14%，但是蛋白去除率是5種方法中最低的。木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法比單一方法具有更好地除蛋白效果，蛋白去除率高達97.98%，多糖損失率18.76%。

2.5 蠶蛹多糖除蛋白質方法的定性分析

圖5 蠶蛹粗多糖(A)和木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫蛋白蠶蛹多糖(B)的紫外-可見光光譜圖Fig.5 UV-visible scanning spectra of silkworm pupa polysaccharides before and after deproteinization by papain-TCA method

由圖5可知，蠶蛹粗多糖在190～300nm范圍內吸光度均保持較大的值，木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫蛋白蠶蛹多糖在260～280nm蛋白質特征吸收區(qū)的吸收明顯降低，表明絕大部分蛋白已經脫除，僅有少部分蛋白與多糖緊密結合形成糖肽或糖蛋白難以去除。

3 結 論

本實驗分別考察了Sevag法、TCA法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法和木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫除蠶蛹多糖蛋白的效果。結果表明，木瓜蛋白酶-化學聯(lián)用法脫除蠶蛹多糖蛋白效果明顯優(yōu)于單一的脫蛋白方法，其中木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫除蠶蛹粗多糖中的蛋白效果最好，經1次處理蛋白去除率和多糖損失率分別為97.98%和18.76%，基本能將粗多糖中的蛋白除去，同時并沒有增加多糖的損失，可得到比較理想的脫蛋白效果。該法效果良好、操作簡單，是一種值得推廣使用的脫蛋白方法。

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A Comparative Investigation into Deproteinization Methods for Silkworm Pupa Polysaccharides

WU Shan-gang1,2，LAI Tai-jun1，SUN Jian-hua1，LIU Xu-hui1,3，TONG Zhang-fa1，LIAO Dan-kui1,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China；2. Liuzhou Medical College, Liuzhou 545006, China；3. Department of Chemistry and Life Science, Hechi University, Yizhou 546300, China)

Protein removal rate and polysaccharide loss rate were used to evaluate and compare the effectiveness of Savag, s method, trichloroacetic acid (TCA) method, papain method and papain-TCA (papain hydrolysis followed by TCA precipitation) method in deproteinizing silkworm pupa polysaccharides. Papain-TCA method was found to be the best method for the deproteinization of silkworm pupa polysaccharides, and the optimal operating conditions were 1.5 h hydrolysis with papain at an enzyme-to-substrate of 2.0% and 50 ℃ followed by once treatment with TCA. A protein removal rate of 97.98% and a polysaccharide loss rate of 18.76% were achieved under such conditions. Only one absorption peak was observed in the UV-visible scanning spectrum of deporteinized silkworm pupa polysaccharides, indicating the removal of almost all proteins.

pupa；polysaccharide；protein；removal

R284.2

A

1002-6630(2011)14-0021-04

2010-08-25

廣西自然科學基金項目(桂科自0728237)；廣西壯族自治區(qū)教育廳科研項目(200607MS031)；廣西大學基金項目(X071029)

伍善廣(1974—)，男，博士研究生，研究方向為藥物新劑型。E-mail：wusg1974@163.com

*通信作者：廖丹葵(1967—)，女，教授，博士，研究方向為精細化工、中草藥有效成分提取。E-mail：liaodk@gxu.edu.cn