伍善廣，賴泰君，孫建華，劉旭輝,3，童張法，廖丹葵,*

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.柳州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 廣西 柳州 545006；3.河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西 宜州 546300)

蠶蛹多糖脫蛋白方法研究

伍善廣1,2，賴泰君1，孫建華1，劉旭輝1,3，童張法1，廖丹葵1,*

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.柳州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 廣西 柳州 545006；3.河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西 宜州 546300)

以蛋白去除率和多糖損失率為指標(biāo)，比較Sevag法、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法和木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫除蠶蛹多糖蛋白的效果。結(jié)果顯示：木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用效果最好，其脫蛋白的最佳條件為木瓜蛋白酶用量[E]/[S] 2.0%、酶解溫度50℃、酶解反應(yīng)1.5h、采用TCA法除蛋白1次，此時(shí)蛋白去除率為97.98%，多糖損失率為18.76%；紫外光譜掃描定性實(shí)驗(yàn)顯示脫蛋白的多糖在260～280nm處只有少量吸收，表明大多數(shù)蛋白已去除。木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法是一種有效的多糖脫蛋白方法。

蠶蛹；多糖；蛋白；脫除

近年來，多糖所具有的各種生理功能逐漸為人們所重視，如增強(qiáng)免疫力、降低血糖濃度、降血脂、抗腫瘤、抗疲勞及抗衰老等[1-6]。多糖具有的生理功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，從天然動(dòng)植物提取的多糖，往往含有大量的蛋白質(zhì)，蛋白的存在不僅可能影響其結(jié)構(gòu)和生物活性的研究，且可能導(dǎo)致藥理作用下降。因此，在天然多糖的提取、分離純化及結(jié)構(gòu)研究中，脫蛋白是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。由于多糖常常與蛋白形成糖蛋白復(fù)合物，使蛋白質(zhì)的脫除比較困難[7]。國(guó)內(nèi)外對(duì)粗多糖脫蛋白方法研究較多的有三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)法、Savag法和酶法等[8-10]。以往研究發(fā)現(xiàn)TCA法脫蛋白時(shí)多糖損失較大[11]，Sevag法需要反復(fù)多次使用，且可能導(dǎo)致部分多糖水解[12]。采用化學(xué)法與酶法聯(lián)用，由于酶可以使大部分的游離蛋白質(zhì)和部分結(jié)合蛋白水解，減少了后續(xù)有機(jī)溶劑除蛋白的次數(shù)，從而降低了多糖隨凝膠物沉淀而損失的可能，可以獲得較好的效果[13]。

蠶蛹(silkworm pupa)為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾(Bombyχ moil L.)的蛹[14]，為藥膳同源傳統(tǒng)中藥材，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。蠶蛹多糖是蠶蛹中的主要活性成分之一，藥理實(shí)驗(yàn)表明，蠶蛹多糖具有明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用[15-18]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)水提醇沉法提取蠶蛹多糖的工藝進(jìn)行研究[19]，但該方法所獲得的蠶蛹粗多糖中含有一定量的蛋白質(zhì)?；诓煌摰鞍追椒ǖ奶攸c(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)分別采用Sevag法、三氯乙酸法(TCA法)、酶法以及兩法聯(lián)用進(jìn)行脫蛋白研究，考察脫蛋白工藝，以確定適于蠶蛹多糖脫蛋白的方法，為進(jìn)一步分離純化蠶蛹多糖提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蠶蛹粗多糖(多糖含量為質(zhì)量百分比16.9%) 自制；牛血清蛋白 美國(guó)Sigma公司；木瓜蛋白酶(酶活為36萬U/g) 南寧市龐博生物技術(shù)公司；其他試劑為分析純。

BS110S型分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司；H-1650型高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；UV-2102P型紫外分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司。1.2脫蛋白實(shí)驗(yàn)

1.2.1 Sevag法脫蛋白

取1g/100mL粗多糖溶液50mL，加入其體積1/5的Sevag試劑(V正丁醇∶V氯仿，1/5)，劇烈振搖20min，4000r/min離心，取出部分上層水溶液，得第1次脫蛋白多糖溶液，水溶液重復(fù)上述操作。取5份樣品，用上述步驟分別處理1、2、3、4、5次，測(cè)定不同處理次數(shù)蛋白去除率和多糖損失率。

1.2.2 三氯乙酸法(TCA法)脫蛋白

取1g/100mL粗多糖溶液50mL，分別加入等體積TCA溶液使其體積分?jǐn)?shù)分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，90r/min振蕩20min，靜置1h，4000r/min離心15min并棄去沉淀。確定脫蛋白效果最好的TCA體積分?jǐn)?shù)后，考察TCA法不同脫蛋白次數(shù)的效果。

1.2.3 木瓜蛋白酶法脫蛋白

取5管1g/100mL粗多糖溶液(50mL/管，下同)放入37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，加入蛋白酶在一定溫度下酶解一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)瓶放入100℃沸水浴中滅酶10min，冷卻至室溫，測(cè)定溶液中蛋白含量和多糖含量。采用單因素試驗(yàn)法，分別考察蛋白酶加入量([E]/ [S])、酶解溫度以及酶解時(shí)間對(duì)蠶蛹多糖的脫蛋白的影響，以獲得最佳酶法脫蛋白條件。

1.2.4 木瓜蛋白酶法與Sevag法聯(lián)用脫蛋白

將1g/100mL粗多糖溶液50mL于37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，按1.2.3節(jié)得到的木瓜蛋白酶脫蛋白最優(yōu)條件進(jìn)行脫蛋白實(shí)驗(yàn)，再按1.2.1節(jié)Sevag法脫蛋白所述實(shí)驗(yàn)條件脫蛋白1次后，上層水溶液即為木瓜蛋白酶法-Sevag法聯(lián)用脫蛋白多糖溶液。

1.2.5 木瓜蛋白酶法與TCA法聯(lián)用脫蛋白

取1g/100mL粗多糖溶液50mL，于37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，按1.2.3節(jié)得到的木瓜蛋白酶脫蛋白最優(yōu)條件進(jìn)行脫蛋白實(shí)驗(yàn)，再用1.3.2節(jié)TCA法脫蛋白最優(yōu)條件處理1次，溶液經(jīng)4000r/min離心15min棄去沉淀，即得木瓜蛋白酶法-TCA法聯(lián)用脫蛋白多糖溶液。

1.3 蛋白質(zhì)及多糖含量測(cè)定方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[20]，用牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，牛血清白蛋白質(zhì)量濃度C與吸光度A之間的回歸方程為A=0.005C＋0.0362(r=0.9984)，線性范圍20.0～100.0μg/mL。

1.3.2 多糖含量的測(cè)定

蠶蛹多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸比色法[9]，用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，總糖質(zhì)量濃度C與吸光度A之間的回歸方程為A=13.414C＋0.0063(r=0.9988)，線性范圍為0.01～0.06mg/mL。

稱取粗多糖配制成含量約為1g/100mL的溶液，按照上述各脫蛋白方法進(jìn)行脫蛋白處理，并將處理后所得溶液真空干燥至質(zhì)量恒定，分別測(cè)定蛋白質(zhì)及多糖含量，按下式計(jì)算蛋白去除率和多糖損失率。

式中：Ri為粗多糖中蛋白質(zhì)量/g；Rj為除蛋白處理后樣品中蛋白質(zhì)量/g。

式中：Ti為粗多糖中多糖質(zhì)量/g；Tj為除蛋白處理后樣品中多糖質(zhì)量/g。

1.4 蠶蛹多糖除蛋白質(zhì)方法的定性分析

分別稱取原料粗多糖、最優(yōu)脫蛋白方法制備得到的蠶蛹多糖各100mg，用蒸餾水溶解定容至50mL，對(duì)溶液進(jìn)行紫外光譜掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sevag法脫蛋白效果

由圖1可知，蛋白去除率隨著脫蛋白次數(shù)增加而上升，而多糖損失率則變化不大，其中Sevag法處理5次后，蛋白質(zhì)去除率為30.20%、多糖損失率為10.14%，即大部分蛋白仍與多糖結(jié)合未能去除。

圖1 Sevag法脫除蠶蛹多糖蛋白質(zhì)的效果Fig.1 Effect of number of Sevag deproteinizations on protein removal rate and polysaccharide loss rate

2.2 三氯乙酸法(TCA法)脫蛋白效果

圖2 三氯乙酸(TCA)法脫蛋白效果Fig.2 Effect of TCA concentration and number of deproteinizations on protein removal rate and polysaccharide loss rate

由圖2A可看出，隨著TCA體積分?jǐn)?shù)的增加，蛋白去除率升高先后降低，當(dāng)TCA體積分?jǐn)?shù)為3.0%時(shí)脫蛋白效果最好，蛋白去除率為59.41%、多糖損失率為5.14%。由圖2B可以看出，蛋白去除率和多糖損失率均隨著脫蛋白次數(shù)增加而增大，脫蛋白2次蛋白去除率達(dá)75.52%，但多糖損失率則達(dá)18.61%。脫蛋白3次時(shí)蛋白脫除率達(dá)80.66%、多糖損失率為22.84%。

2.3 木瓜蛋白酶法脫蛋白效果

由圖3可知，粗多糖蛋白質(zhì)去除率隨著酶用量的增加而增加，但當(dāng)酶用量[E]/[S]超過2.0%后，蛋白質(zhì)去除率增加不明顯；隨著酶解溫度的升高，蛋白質(zhì)去除率則表現(xiàn)為先升后降，酶解溫度50℃時(shí)蛋白質(zhì)去除率最高；隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)蛋白質(zhì)去除率增大，當(dāng)酶解1.5h后蛋白脫除率變化不明顯。

綜上所述，木瓜蛋白酶脫蛋白的最佳工藝條件為酶用量[E]/[S] 2.0%、酶解溫度50℃、酶解反應(yīng)時(shí)間1.5h，此時(shí)蛋白質(zhì)去除率為80.52%，多糖損失率為9.94%。

圖3 木瓜蛋白酶法去蛋白效果Fig.3 Effect of papain dosage, hydrolysis temperature and hydrolysis time on protein removal rate and polysaccharide loss rate

2.4 各種方法脫蛋白效果比較

圖4 各種脫蛋白方法的結(jié)果比較Fig.4 Comparisons of protein removal rates and polysaccharide loss rates obtained by different deproteinization methods

各取1g/100mL粗多糖溶液50mL，分別用Sevag法(處理5次)、三氯乙酸法(處理3次)、木瓜蛋白酶法(酶法)、木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法(酶-Sevag法，其中Sevag法處理3次)和木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法(酶-TCA法，其中TCA法處理1次)進(jìn)行脫蛋白處理，結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法蛋白去除率最高，而Sevag法蛋白去除率最低。采用傳統(tǒng)Sevag法對(duì)粗多糖進(jìn)行5次處理后，雖然多糖損失率只有10.14%，但是蛋白去除率是5種方法中最低的。木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法比單一方法具有更好地除蛋白效果，蛋白去除率高達(dá)97.98%，多糖損失率18.76%。

2.5 蠶蛹多糖除蛋白質(zhì)方法的定性分析

圖5 蠶蛹粗多糖(A)和木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫蛋白蠶蛹多糖(B)的紫外-可見光光譜圖Fig.5 UV-visible scanning spectra of silkworm pupa polysaccharides before and after deproteinization by papain-TCA method

由圖5可知，蠶蛹粗多糖在190～300nm范圍內(nèi)吸光度均保持較大的值，木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫蛋白蠶蛹多糖在260～280nm蛋白質(zhì)特征吸收區(qū)的吸收明顯降低，表明絕大部分蛋白已經(jīng)脫除，僅有少部分蛋白與多糖緊密結(jié)合形成糖肽或糖蛋白難以去除。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分別考察了Sevag法、TCA法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法和木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫除蠶蛹多糖蛋白的效果。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶-化學(xué)聯(lián)用法脫除蠶蛹多糖蛋白效果明顯優(yōu)于單一的脫蛋白方法，其中木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫除蠶蛹粗多糖中的蛋白效果最好，經(jīng)1次處理蛋白去除率和多糖損失率分別為97.98%和18.76%，基本能將粗多糖中的蛋白除去，同時(shí)并沒有增加多糖的損失，可得到比較理想的脫蛋白效果。該法效果良好、操作簡(jiǎn)單，是一種值得推廣使用的脫蛋白方法。

[1]VINCENT E, OOI C, LIU Fang. Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes[J]. Current Medicinal Chemistry, 2000, 7(7)∶ 715-729.

[2]YE Hong, WANG Keqi, ZHOU Chunhong, et al. Purification, antitumor and antioxidant activities in vitro of polysaccharides from the brown seaweed Sargassum pallidum[J]. Food Chemistry, 2008, 111(2)∶ 428-432.

[3]JIANG Yan-hua, JIANG Xiao-lu, WANG Peng. The antitumor and antioxidative activities of polysaccharides isolated from Isaria farinosa B05[J]. Microbiological Research, 2008, 163(4)∶ 424-430.

[4]TONG Haibin, XIA Fengguo, FENG Kai. Structural characterization and in vitro antitumor activity of a novel polysaccharide isolated from the fruiting bodies of Pleurotus ostreatus[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(4)∶ 1682-1686.

[5]ZHAO Liyan, DONG Yanhong, CHEN Guitang, et al. Extraction, purification, characterization and antitumor activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 80(3)∶ 783-789.

[6]HUANG Shengquan, NING Zhengxiang. Extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum and its immune enhancement activity[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2010, 47(3)∶ 336-341.

[7]劉成梅, 萬茵, 涂宗財(cái). 百合多糖脫蛋白方法的研究[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(1)∶ 89-90.

[8]余華. 海帶多糖中蛋白質(zhì)去除方法的對(duì)比研究[J]. 成都大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 24(4)∶ 265-268.

[9]秦衛(wèi)東, 馬利華, 陳學(xué)紅. 生姜多糖的提取及脫蛋白研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(4)∶ 218-220.

[10]董英, 張艷芳, 孫艷輝. 水飛薊粗多糖脫蛋白方法的比較[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(12)∶ 82-84.

[11]曾慶帥, 李小定. 吳茱萸粗多糖堿法提取及脫蛋白方法研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(8)∶ 111-114.

[12]WANG Xia, YUAN Yong, WANG Kainai, et al. Deproteinization of gellan gum produced by Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461[J]. Journal of Biotechnology, 2007, 128(2)∶ 403-407.

[13]馬麗, 覃小林, 劉雄民, 等. 不同的脫蛋白方法用于螺旋藻多糖提取工藝的研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(6)∶ 116-119.

[14]藏其中, 萬淑瑩, 何光星, 等. 蠶蛹多糖的分離和分析[J]. 中成藥, 1992, 14(3)∶ 35-36.

[15]ZHANG Min, HAGA A, SEKIGUCHI H, et al. Structure of insect chitin isolated from beetle larva cuticle and silkworm (Bombyχ mori) pupa exuvia[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2000, 27 (1)∶ 99-105.

[16]孫龍, 馮穎, 何釗, 等. 蠶蛹多糖的堿液提取及免疫活性初步研究[J].林業(yè)科學(xué)研究, 2007, 20(6)∶ 782-786.

[17]黃林清, 周世文, 張?jiān)娖? 等. 蠶蛹多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 18(1)∶ 11-12.

[18]王國(guó)基, 殷偉芬, 王俊, 等. 蠶蛹多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)∶ 醫(yī)學(xué)版, 2007, 17(5)∶ 373-375.

[19]賴泰君, 劉旭輝, 孫建華, 等. 蠶蛹多糖提取工藝的研究[J]. 中藥材, 2009, 32(7)∶ 117-139.

[20]王多寧, 趙雁武, 田芙蓉. 考馬斯亮藍(lán)微盤比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 22(6)∶ 528-529.

A Comparative Investigation into Deproteinization Methods for Silkworm Pupa Polysaccharides

WU Shan-gang1,2，LAI Tai-jun1，SUN Jian-hua1，LIU Xu-hui1,3，TONG Zhang-fa1，LIAO Dan-kui1,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China；2. Liuzhou Medical College, Liuzhou 545006, China；3. Department of Chemistry and Life Science, Hechi University, Yizhou 546300, China)

Protein removal rate and polysaccharide loss rate were used to evaluate and compare the effectiveness of Savag, s method, trichloroacetic acid (TCA) method, papain method and papain-TCA (papain hydrolysis followed by TCA precipitation) method in deproteinizing silkworm pupa polysaccharides. Papain-TCA method was found to be the best method for the deproteinization of silkworm pupa polysaccharides, and the optimal operating conditions were 1.5 h hydrolysis with papain at an enzyme-to-substrate of 2.0% and 50 ℃ followed by once treatment with TCA. A protein removal rate of 97.98% and a polysaccharide loss rate of 18.76% were achieved under such conditions. Only one absorption peak was observed in the UV-visible scanning spectrum of deporteinized silkworm pupa polysaccharides, indicating the removal of almost all proteins.

pupa；polysaccharide；protein；removal

R284.2

A

1002-6630(2011)14-0021-04

2010-08-25

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(桂科自0728237)；廣西壯族自治區(qū)教育廳科研項(xiàng)目(200607MS031)；廣西大學(xué)基金項(xiàng)目(X071029)

伍善廣(1974—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬?。E-mail：wusg1974@163.com

*通信作者：廖丹葵(1967—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)榫?xì)化工、中草藥有效成分提取。E-mail：liaodk@gxu.edu.cn