謝慧明，朱瑩瑩，張仕發(fā)，伍志剛

(合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

當(dāng)歸多糖磁性超濾膜分級(jí)分離

謝慧明，朱瑩瑩*，張仕發(fā)，伍志剛

(合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

基膜為80000的聚砜超濾膜經(jīng)原位生成法制備得磁性超濾膜。在壓力為0.2MPa條件下改變磁場(chǎng)強(qiáng)度，其截留相對(duì)分子質(zhì)量可調(diào)控范圍為31000～73000。利用此膜對(duì)純度為97.5%的當(dāng)歸多糖進(jìn)行連續(xù)分級(jí)分離，在不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下得到3個(gè)樣品(A、B和C)。高效凝膠色譜法測(cè)定樣品A、B以及C的重均相對(duì)分子質(zhì)量分別為86317、19989、62461，樣品A中相對(duì)分子質(zhì)量為70000～100000的當(dāng)歸多糖占70%左右；樣品B中相對(duì)分子質(zhì)量為10000～30000的當(dāng)歸多糖占95%左右；樣品C中相對(duì)分子質(zhì)量為50000～70000的當(dāng)歸多糖占80%左右。

當(dāng)歸多糖；磁性超濾膜；高效凝膠液相色譜；連續(xù)分離

當(dāng)歸多糖具有很強(qiáng)的生物活性，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明當(dāng)歸多糖可以提高免疫力[1]、去除自由基[2]、激活補(bǔ)體活性等功效[3]、還具有鎮(zhèn)痛[4]、保護(hù)胃腸黏膜[5]的作用，另外對(duì)抗腫瘤[6]、抗輻射損傷[7]也均呈現(xiàn)較好療效。當(dāng)歸多糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布廣泛，其生物活性與其相對(duì)分子質(zhì)量范圍密切相關(guān)的，多糖相對(duì)分子質(zhì)量太大或太小均會(huì)影響其活性，其中抗補(bǔ)體活性高，免疫活性強(qiáng)的當(dāng)歸多糖其相對(duì)分子質(zhì)量多在10000～30000之間[8-10]，能保護(hù)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖反應(yīng)的當(dāng)歸多糖其相對(duì)分子質(zhì)量多在50000～70000之間[11-12]，而具有抑制腫瘤作用的當(dāng)歸多糖相對(duì)分子質(zhì)量一般在70000以上[13-14]。目前按相對(duì)分子質(zhì)量分離當(dāng)歸多糖的方法主要有超濾法和凝膠柱層析法，其中超濾法[15-16]采用的均是截留相對(duì)分子質(zhì)量不變的膜，不能實(shí)現(xiàn)當(dāng)歸多糖的連續(xù)分級(jí)分離。本實(shí)驗(yàn)擬采用實(shí)驗(yàn)室自制的磁性超濾膜，通過(guò)改變磁場(chǎng)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量在10000～100000之間的當(dāng)歸多糖的連續(xù)分級(jí)分離。根據(jù)不同相對(duì)分子質(zhì)量多糖具有不同的側(cè)重功效，目標(biāo)多糖分為3段不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍：10000～30000、50000～70000、70000～100000。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

當(dāng)歸產(chǎn)于甘肅岷縣；葡萄糖(AR) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚(重蒸餾；AR)、無(wú)水乙醇(AR) 上海中試化工總公司；聚砜超濾膜 安得膜分離技術(shù)工程有限公司；右旋糖酐對(duì)照品(Mw分別為200000、133800、84400、41100、21400、7100、4600) 中國(guó)藥品生物制品鑒定所；FeCl2·4H2O(AR) 天津太茂化學(xué)試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平 美國(guó)西特公司；多功能膜分離設(shè)備 自制；UV-1600紫外分光光度計(jì) 北京奧生源科技有限責(zé)任公司；1100型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；Shodex OHPak SB-804HQ凝膠色譜柱 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 當(dāng)歸多糖的制備

提取工藝：①當(dāng)歸粉碎，3倍量(mL/g)乙醇浸泡24h，收集濾渣，烘干備用；②水法浸提當(dāng)歸多糖工藝條件：料液比1∶10(g/mL)，浸提溫度90℃，浸提時(shí)間3h，浸提2次；③過(guò)濾，離心，收集濾液減壓濃縮，濃縮液經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，得當(dāng)歸多糖粗提物備用。

超濾純化：當(dāng)歸多糖粗提物溶于水中配成溶液，選擇截留相對(duì)分子質(zhì)量為10000的聚砜超濾膜對(duì)其進(jìn)行超濾分離，得到的截留液再用截留相對(duì)分子質(zhì)量為100000的聚砜超濾膜進(jìn)行超濾分離，收集透過(guò)液，得到相對(duì)分子質(zhì)量在10000～100000當(dāng)歸多糖溶液，凍干備用。

1.3.2 磁性超濾膜的制備與檢測(cè)

圖1 Fe3O4-PSF磁性復(fù)合超濾膜制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of the device for the preparation of Fe3O4-PSF magnetic ultrafiltration membrane

原位生成法制備磁性復(fù)合膜[17]：分別選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為70000、80000、90000的聚砜超濾膜作為磁性超濾膜的基體膜，無(wú)水乙醇浸泡基體膜10min后，將其置于超濾膜制備反應(yīng)器中，如圖1所示。反應(yīng)器兩側(cè)加入的溶液分別為2mol/L NaOH溶液和0.2mol/L FeCl2乙醇溶液，反應(yīng)45min后將復(fù)合膜取出，洗滌、晾干，分別記為膜1、2、3，保存?zhèn)溆谩?/p>

截留相對(duì)分子質(zhì)量的檢測(cè)：采用葡聚糖檢測(cè)其截留相對(duì)分子質(zhì)量。由于壓力過(guò)小，自制的磁性超濾膜通量小，過(guò)濾的速度比較慢；而壓力過(guò)大，自制的磁性超濾膜會(huì)存在破裂現(xiàn)象，因此選擇工作壓力0.2MPa。實(shí)驗(yàn)裝置示意圖見(jiàn)圖2，分別將不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖加入料液瓶中，在磁場(chǎng)強(qiáng)度0T、壓力0.2MPa條件下，待流量穩(wěn)定后收集一定量的截留液和透過(guò)液，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，計(jì)算截留率R，規(guī)定R≥90%的截留基準(zhǔn)物相對(duì)分子質(zhì)量為膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量。

式中：R為截留率/%；C透為透過(guò)液濃度/(mol/L)；C原為原料液濃度/(mol/L)。

圖2 磁場(chǎng)超濾裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of magnetic ultrafiltration device

1.3.3 磁性超濾膜截留相對(duì)分子質(zhì)量可調(diào)控范圍的測(cè)定

在0.2MPa條件下，0.2～1.0T間調(diào)節(jié)磁場(chǎng)強(qiáng)度，以葡聚糖為基準(zhǔn)物，測(cè)出不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量葡聚糖的截留率，得出磁性超濾膜截留相對(duì)分子質(zhì)量的可調(diào)控范圍。

1.3.4 當(dāng)歸多糖分級(jí)分離

根據(jù)3張磁性超濾膜截留相對(duì)分子質(zhì)量的調(diào)控范圍，選取最合適分離目標(biāo)當(dāng)歸多糖的膜，調(diào)節(jié)適宜的磁場(chǎng)強(qiáng)度，收集透過(guò)液或截留液，凍干稱(chēng)量，高效凝膠液相色譜分析其相對(duì)分子質(zhì)量范圍。

1.3.5 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

色譜條件：參照文獻(xiàn)[18]的方法。色譜柱：Shodx OHPaK SB-804HQ；流動(dòng)相 0.71%硫酸鈉溶液(內(nèi)含0.02%疊氮化鈉)；柱溫35℃；流速為0.5mL/min；示差折光檢測(cè)器。

對(duì)照品溶液：精確稱(chēng)取右旋糖酐對(duì)照品，流動(dòng)相配成3mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾。

供試品溶液：精確稱(chēng)取超濾后凍干的當(dāng)歸多糖，流動(dòng)相配成3mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取重均分子質(zhì)量為200000、84400、41100、21400、10000、4600D的右旋糖苷對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰值保留時(shí)間，GPC軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定：取供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，根據(jù)峰值保留時(shí)間，GPC軟件計(jì)算樣品的重均相對(duì)分子質(zhì)量和數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量以及相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度。

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸多糖的制備結(jié)果

稱(chēng)取當(dāng)歸多糖粗提物50g，配成10g/L的溶液，選擇截留相對(duì)分子質(zhì)量為10000的聚砜超濾膜進(jìn)行超濾分離，得到的截留液再用截留相對(duì)分子質(zhì)量為100000的聚砜超濾膜進(jìn)行超濾分離，收集透過(guò)液，得到相對(duì)分子質(zhì)量在10000～100000當(dāng)歸多糖溶液，凍干得當(dāng)歸多糖10.22g，苯酚-H2SO4法測(cè)得其純度為97.5%。

2.2 磁性超濾膜的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 膜截留相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果

圖3 無(wú)外加磁場(chǎng)下膜截留相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定Fig.3 Determination of MWCO of the prepared magnetic composite membrane without additional magnetic field

由圖3可知，膜1、2、3截留率(R)為90%對(duì)應(yīng)的基準(zhǔn)物相對(duì)分子質(zhì)量分別為65000、73000、83000。表明在超濾壓力0.2MPa、無(wú)外加磁場(chǎng)的條件下，用截留相對(duì)分子質(zhì)量為70000、80000、90000的基體膜制備的磁性復(fù)合超濾的截留相對(duì)分子質(zhì)量分別為65000、73000、83000。磁性膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)基膜減小，是由于采用原位生成法制備磁性膜時(shí)，生成的納米Fe3O4粒子絕大多數(shù)沉積在膜孔道中，致使膜孔變小，膜截留相對(duì)分子質(zhì)量降低。

2.2.2 磁性超濾膜截留相對(duì)分子質(zhì)量可調(diào)控范圍的測(cè)定

由圖4可知，0.2MPa條件下，在0.2～1.0T的范圍內(nèi)改變磁場(chǎng)強(qiáng)度，磁性超濾膜1～3的截留相對(duì)分子質(zhì)量調(diào)控范圍分別為25000～51000、31000～63000、42000～ 74000。其中不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下，膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量如表1所示。

圖4 磁性超濾膜截留相對(duì)分子質(zhì)量可調(diào)控范圍的測(cè)定Fig.4 Determination of MWCO range of the prepared magnetic composite membrane

表1 磁性超濾膜截留相對(duì)分子質(zhì)量可調(diào)控范圍的測(cè)定Table 1 MWCO range of the prepared magnetic composite membrane under different magnetic field intensities

根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果以及目標(biāo)多糖的3段不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍：10000～30000、50000～70000、70000～100000，選用膜2進(jìn)行以后實(shí)驗(yàn)較為適宜。

2.3 當(dāng)歸多糖分級(jí)分離結(jié)果

2.3.1 超濾分級(jí)分離

稱(chēng)取凍干后的當(dāng)歸多糖10.0g，配成5g/L的溶液，加入到料液瓶中，在0T、0.2MPa條件下收集截留液得樣品A；再將透過(guò)液加入料液瓶中，保持壓力不變，調(diào)節(jié)磁場(chǎng)強(qiáng)度至1.0T收集透過(guò)液得樣品B；最后調(diào)節(jié)磁場(chǎng)強(qiáng)度至0.6T收集截留液得樣品C，凍干得到樣品A 3.97g、樣品B 2.86g、樣品C 1.98g。

2.3.2 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以標(biāo)準(zhǔn)品的重均相對(duì)分子質(zhì)量MW的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間tR為橫坐標(biāo)，用GPC軟件得到標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線lg(MW)=7.319-0.253tR(r=-0.9931)。

2.3.2.2 樣品相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

高效凝膠色譜法分別測(cè)定其重均相對(duì)分子質(zhì)量、數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布如表2所示。相對(duì)分子質(zhì)量累積分布曲線如圖5所示。

表2 樣品的重均相對(duì)分子質(zhì)量、數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度測(cè)定結(jié)果Table 2 Mw, Mn and Mw/Mn of fractions A, B and C

樣品A中，重均相對(duì)分子質(zhì)量為86317，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為40375，相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度為2.14，相對(duì)分子質(zhì)量在70000～100000的當(dāng)歸多糖占70%左右；樣品B中，重均相對(duì)分子質(zhì)量為19989，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為10359，相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度為1.93，相對(duì)分子質(zhì)量在10000～30000的當(dāng)歸多糖占95%左右；樣品C中，重均相對(duì)分子質(zhì)量為62461，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為31267，相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度為2.00，相對(duì)分子質(zhì)量在50000～70000的當(dāng)歸多糖占80%左右。

由此得出，在壓力0.2MPa條件下，通過(guò)改變磁場(chǎng)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了一張膜對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量當(dāng)歸多糖的連續(xù)分級(jí)分離。

圖5 樣品A、B、C相對(duì)分子質(zhì)量累積分布曲線Fig.5 Cumulative weight distribution curve of molecular weight for fractions A, B and C

3 結(jié) 論

水法浸提得到的當(dāng)歸多糖粗提物，經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量為10000和100000的聚砜超濾膜純化后，得純度為97.5%的白色當(dāng)歸多糖。

采用原位生成法，以截留相對(duì)分子質(zhì)量為80000的聚砜超濾膜作為基膜制備得到磁性超濾膜。以葡聚糖為基準(zhǔn)物，測(cè)定此膜在0.2MPa、0.0～1.0T條件下的截留相對(duì)分子質(zhì)量可調(diào)控范圍為31000～73000。

用此磁性超濾膜對(duì)純化后當(dāng)歸多糖進(jìn)行分級(jí)分離，不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下收集截留液或透過(guò)液，凍干得到3個(gè)樣品，高效凝膠色譜對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。其中A樣品質(zhì)量3.97g、Mw為86317、相對(duì)分子質(zhì)量在70000～100000的當(dāng)歸多糖占70%左右；B樣品質(zhì)量2.86g、Mw為19989、相對(duì)分子質(zhì)量在10000～30000的當(dāng)歸多糖占95%左右；C樣品質(zhì)量1.98g、Mw為62461、相對(duì)分子質(zhì)量在50000～70000的當(dāng)歸多糖占80%左右。

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Use of a Magnetic Ultrafiltration Membrane for the Separation of Angelica sinensis Root Polysaccharides

XIE Hui-ming，ZHU Ying-ying*，ZHANG Shi-fa，WU Zhi-gang
(Engineering Research Center of Bio-Process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

A magnetic ultrafiltration membrane whose molecular weight cut-off (MWCO) can be between 31000 and 73000 under 0.2 MPa pressure and varying magnetic field intensity was prepared by in situ synthesis on the basis of a polysulfone ultrafiltration membrane with a MWCO of 80000 and used sequentially separate Angelica sinensis root polysaccharides with a purity of 97.5%. As a result, three fractions were obtained under various magnetic filed intensities and named as A, B and C, respectively. Their respective weight average molecular weights (Mw) were determined by high performance gel permeation chromatography (HPGPC) to be 86317, 19989 and 62461. Polysaccharides with a relative molecular weight ranging from 70000 to 100000 was 70% in fraction A. Roughly 95% of fraction B consisted of polysaccharides with a relative molecular weight between 10000 and 30000. Fraction C contained approximately 80% of polysaccharides whose molecular weight was in the range of 50000-70000.

polysaccharides from the root of Angelica sinensis；magnetic ultrafiltration membrane；high performance gel permeation chromatography (HPGPC)；continuous separation

TQ315

A

1002-6630(2011)14-0011-05

2010-07-26

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA100404)

謝慧明(1955—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：xiehuiming-6@163.com

*通信作者：朱瑩瑩(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及蛋白質(zhì)工程加工。E-mail：zhuyingying0914@gmail.com